20世纪60年代以来,肠外营养(parenteral nutrition, PN)逐渐运用于临床并取得了显著疗效。PN的出现无疑解决了那些无法经胃肠道进食病人的营养问题,维持了肠功能障碍患者的营养,延长了患者的生命；全肠外营养(total parenteral nutrition, TPN)更是治疗无法由肠内营养(enteral nutrition, EN)提供全部营养的短肠综合征(short bowel syndrome, SBS)及肠道运动功能障碍等肠衰竭(intestinal failure, IF)患者的唯一选择。然而PN在提供能量及营养物质的同时,也会引起肝脏的损害。早在20世纪70年代,Peden等就发现长期的PN容易导致患者出现胆汁淤积以及肝脏脂肪变性,PN伴随的肝功能异常以及胆汁淤积一直是影响IF患者预后的难题。截止到目前,仍然没有对这一现象广为接受的精确认识,人们传统地认为PN所含的某种成分或者缺乏某种成分导致了肝脏损害,这种简单的认识逐渐被取而代之,目前认为肝损害是由一系列因素共同造成的,这些因素是接受PN患者的综合状态而非PN本身。所以,这一肝损害的命名由之前的“肠外营养相关性肝损害”(PN-associated liver disease, PNALD)逐渐演变为“肠衰竭相关性肝损害”(IF-associated liver disease, IFALD)。IFALD是指排除其他潜在引起肝脏损害的原因,接受长期PN支持治疗的IF患者出现的非机械性梗阻导致的肝功能异常,临床上多以直接胆红素(direct bilirubin, DBIL) ≧2mg/dL (34μmol/L)作为其诊断标准。IFALD主要包括三种病理学改变：肝脏脂肪变性、胆汁淤积和胆石形成。其中,胆汁淤积可以导致肝硬化甚至肝衰竭,是致死性的并发症。研究表明,在接受长期PN支持治疗的患者中,有高达40～60%的婴幼儿以及15-40%的成年人会出现肝功能异常,最终发展为肝衰竭。而肝脏病变在停止使用PN之前是无法缓解的,一旦进展至肝衰竭,目前治疗上仅有肝移植或者肝肠联合移植,然而由于供体的缺乏及移植术后感染等并发症的发生,移植面临着巨大的难题,这就更加突出了早期治疗及预防IFALD的重要性。维生素D作为一种脂溶性维生素,与人类健康关系较为密切的是维生素D2和维生素D3。生理情况下,维生素D的获得途径主要有两种：一是由太阳光照射皮肤,将皮肤内的7-脱氢胆固醇转化为维生素D3；二是通过食物摄入,主要是来自植物和真菌中的维生素D2的转化,以及鱼肝油、蛋黄、动物肝脏、黄油及牛奶等动物性食物中的维生素D3。摄入体内的维生素D与特异性的维生素D结合α-球蛋白(vitamin D binding protein, DBP)相结合,在肝脏中经25-羟化酶的作用下形成25-羟维生素D3(25-OHD3),再经1-α羟化酶的作用下,在肾脏中转化为生物活性最强的1,25-(OH)2D3.1,25-(OH)2D3通过与细胞内特异性的维生素D受体(vitam in D receptor, VDR)结合作用于靶组织发挥生物学效应。维生素D除了维持血清钙磷浓度的稳定及改善骨质外,深入的研究发现它在免疫调节系统、抑制细胞坏死、肿瘤的浸润和转移,以及调节内分泌系统等方面也起着至关重要的作用。研究表明：人体全身各组织器官中均存在VDR,如小肠、肝脏、胰腺、血管平滑肌、心肌细胞、肾脏等。因此,维生素D缺乏与多种疾病的发生发展有关。目前临床上普遍接受维生素D的评价指标是25-OHD3,它的生物半衰期是3周左右,较1,25-(OH)2D3(半衰期4-6 h)更为稳定。目前多数学者认为人体内25-OHD3的正常水平为≧30ng/mL。而对于SBS患者,由于肠道吸收面积的显著减少以及功能障碍,加上胆盐重吸收减少以及胆汁中微胶粒的减少,往往导致脂肪消化不良,进而容易引起脂溶性维生素D的缺乏。尤其对于那些需要接受长期PN支持或者采用家庭肠外营养(home parenteral nutrition, HPN)支持治疗的患者,由于长期疾病状态的限制,缺少户外运动和阳光照射,以及缺乏富含维生素D食物的补充,往往成为维生素D不足甚至缺乏的高危患者。既往小样本研究显示,约有40%左右的IF患者存在维生素D的缺乏。而目前对于SBS患者的维生素D常规监测尚无明确方案,欧洲指南推荐每年仅监测1次。与此同时,对于那些已被检测出维生素D不足或者缺乏的SBS患者的治疗也尚无明确的治疗方案。维生素D3的潜在重要生理作用如上所述,但迄今为止,维生素D3在SBS患者中的作用知之甚少。另有研究显示,维生素D3通过与VDR结合,可以激活法尼脂X受体(farnesoid X receptor,FXR)信号通路,进而发挥一系列生物学功能。然而,维生素D3是否可以通过激活FXR信号通路以及调节胆汁酸代谢相关蛋白,进而改善胆汁淤积引起的肝脏损害,参与保护IFALD,目前尚未有文献报道。因此,本研究中我们观察临床SBS患者血清25-OHD3水平,评估SBS患者维生素D及骨密度状况：同时对SBS患者给予维生素D3治疗,观察维生素D3对IFALD的保护作用；此外,我们建立稳定的SBS大鼠IFALD模型,对SBS大鼠进行腹腔注射维生素D3,比较维生素D3补充后SBS大鼠肝功能相关生化指标及肝脏病理等的改变,分析胆汁酸转运关键蛋白的变化,进而探讨维生素D3对大鼠IFALD肝功能的保护作用以及可能机制。第一部分短肠综合征患者维生素D缺乏的临床研究目的：短肠综合征患者由于肠道吸收面积的显著减少以及功能障碍,加上胆盐重吸收减少以及胆汁中微胶粒的减少,往往导致脂肪消化不良,进而容易引起脂溶性维生素D的缺乏。因此本研究旨在分析临床短肠综合征患者血清25-OHD水平及骨密度状况,并评价其与患者临床指标的关系。方法：回顾性分析自2014年1月至2016年1月在本院诊治且病历资料完整的60例短肠综合征患者血清25-OHD水平及骨密度状况,同时收集患者的一般信息、临床病史及实验室指标等。根据患者住院期间血清25-OHD的最低值将患者定义为维生素D缺乏(< 20 ng/ml)、维生素D不足(20～30 ng/ml)与维生素D正常(≧30 ng/ml)。根据骨密度检查T值将患者定义为骨质正常(-1<T值≦+1)、骨量减少(-2.5<T值≦-1)与骨质疏松(T值≦-2.5)。结果：60例短肠综合征患者均伴有不同程度的维生素D不足甚至缺乏,其中仅仅有3例(5.0%)属于维生素D不足,而有高达57例(95.0%)属于维生素D缺乏。在维生素D缺乏的患者中,大部分(65.0%)属于重度维生素D缺乏。组间对比分析显示,剩余小肠长度(B,0.072,P=0.001)及短肠病程(B,-0.066,P=0.020)是影响短肠综合征患者血清25-OHD水平的独立危险因素,残余小肠长度越短、短肠病程越长,则血清25-OHD水平越低。骨密度检查显示60例短肠综合征患者中仅有2例(3.4%)属于骨质正常,41例(68.3%)属于骨量减少,17例(28.3%)属于骨质疏松。组间对比分析显示,血清25-OHD水平(B,0.065,P=0.029)是影响短肠综合征患者骨密度的独立危险因素,血清25-OHD水平越低,越容易出现骨量减少。结论：短肠综合征患者往往伴随着维生素D的不足甚至缺乏,以及骨量减少。对于短肠综合征患者而言,残余小肠长度越短、短肠病程越长,则越容易发生维生素D缺乏。同时,血清25-OHD水平越低,越容易继发骨量减少。在临床工作中,应常规密切监测短肠综合征患者维生素D水平及骨密度状况,并做到及时补充维生素D。第二部分维生素D3改善肠衰竭相关性肝损害的临床观察目的：维生素D3作为一种脂溶性维生素,近几年其生物学效应备受关注,相关研究显示其可以改善胆汁淤积及肝脏脂肪变性。因此本研究旨在通过口服维生素D3对接受长期肠外营养的短肠综合征患者进行前瞻性的随机对照试验,首次从临床实验室生化指标观察维生素D3对肠衰竭相关性肝损害的保护作用。方法：自2014年7月至2015年7月,招募在本院诊治且病历资料完整的11例短肠综合征患者,随机分为实验组(N=6)和对照组(N=5),分别观察1个月。对照组按照临床常规肠外营养治疗方案治疗,实验组在对照组营养方案基础上予以口服维生素D3滴剂,补充方案为800 IU/次,3次/d,总疗程1个月。治疗前及治疗后每周定期取血检测患者肝功能相关生化指标的变化。结果：随着实验时间的延长,对照组患者的谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)以及直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)均逐渐升高,而实验组患者的肝功能相关生化指标(ALT、AST、TBIL、DBIL)基本维持在正常值左右水平并呈下降趋势。至实验第4周时,两组间患者的肝功能相关生化指标(ALT、AST、TBIL、 DBIL)具有显著的统计学差异,实验组患者的DBIL (5.1±2.4μmol/L vs.14.9±4.1 μmol/L, P< 0.05)、TBIL (14.3±3.6μmol/L vs.26.2±6.1μmol/L, P< 0.05)、ALT (36.2±6.1 U/L vs.50.8±8.7 U/L, P< 0.05)及AST(24.1±3.9U/L vs.38.8±7.1 U/L, P<0.05)水平均显著低于对照组患者。结论：维生素D3能显著改善接受长期肠外营养支持治疗的短肠综合征患者肝功能相关生化指标,对短肠综合征患者肠衰竭相关性肝损害具有一定的保护作用,但具体机制有待进一步实验研究。第三部分维生素D3对大鼠肠衰竭相关性肝损害的保护作用及机制研究研究3.1维生素D3保护大鼠肠衰竭相关性肝损害的疗效观察目的：前期的小样本临床观察研究已经显示,维生素D3对短肠综合征患者肠衰竭相关性肝损害具有一定的保护作用。因此本部分为进一步探究肠衰竭相关性肝损害的发病机制,建立有效的大鼠模型,并观察维生素D3对短肠综合征大鼠肠衰竭相关性肝损害的保护作用。方法：选取雄性成年Sprague-Dawley (SD)大鼠12只,体重200-250g,清洁级,代谢笼内喂养,维持12：12小时昼夜循环,温度维持在22℃左右,相对湿度维持在40%-60%,适应性喂养1周后用于实验。随机分为实验组(N=6)和对照组(N=6),两组大鼠均切除75%的小肠,空肠近端及回肠末端各保留约10 cm,空回肠以7-0吻合线对端吻合,建立短肠综合征大鼠模型。从其右侧颈外静脉置管,连续24小时输注营养液至14天。实验组大鼠予以腹腔注射维生素D3(4μg/kg,1次/d,14 d)。分别于术前和术后7天、14天取血,观察肝功能相关生化指标的变化；于术后14天处死大鼠,并在处死前用1 ml微量注射器监测胆汁流量；并取部分肝脏组织行病理检查及电镜检查,观察大鼠肝脏形态结构的变化。结果：两组大鼠的肝功能相关生化指标均随着全肠外营养支持时间的延长而升高。实验第7天,实验组大鼠血清ALT (42.96±4.76 U/L vs.46.45±6.98 U/L, P> 0.05)、AST (145.97±24.75 U/L vs.156.44±36.99 U/L, P> 0.05)、TBIL (2.36±0.26 μmol/L vs.2.45±0.18μmol/L, P> 0.05)和 DBIL (0.66±0.03μmol/L vs.0.75±0.05 μmol/L, P< 0.05)水平均低于对照组,虽然两组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平差异无统计学意义。而到实验第14天,实验组大鼠血清ALT (55.23±6.41 U/L vs.64.01±7.23 U/L, P< 0.05)、AST (177.22±26.42 U/L vs.209.00±31.24 U/L,P< 0.05)、TBIL(3.23±0.21μmol/L vs.3.65±0.23μmol/L, P< 0.05)和DBIL(0.99±0.03 μmol/L vs.1.15±0.06μmol/L, P<0.05)水平均显著低于对照组并具有统计学差异。实验第14天,两组大鼠的胆汁流量均显著降低,并且对照组大鼠的胆汁流量(5.85±1.41μml/min)显著低于实验组(8.23±1.26μml/min) (P<0.05)。肉眼观察对照组大鼠在实验第14天时肝脏颜色明显较实验组淡。H&E染色及电镜检查可见对照组大鼠肝脏脂肪变性程度明显重于实验组。肝脏损伤病理评分结果显示,对照组肝脏损伤程度(1.85±0.41分)明显重于实验组(1.23±0.26分)(P<0.05)。结论：维生素D3能显著降低短肠综合征模型大鼠肠衰竭相关性肝损害的肝脏损害程度,对肠衰竭相关性肝损害起到保护作用,但具体机制有待于进一步研究。研究3.2维生素D3对大鼠胆汁酸代谢相关蛋白的影响目的：前期的临床及动物实验已经显示,维生素D3对短肠综合征伴随的肠衰竭相关性肝损害具有一定的保护作用,而具体机制尚不明确。因此本部分旨在探究维生素D3对接受长期肠外营养支持的短肠综合征大鼠胆汗酸代谢相关蛋白的影响,阐明维生素D3参与保护肠衰竭相关性肝损害的具体机制。方法：选取雄性成年SD大鼠12只,体重200-250g,清洁级,代谢笼内喂养,维持12：12小时昼夜循环,温度维持在22℃左右,相对湿度维持在40%-60%,适应性喂养1周后用于实验。随机分为实验组(N=6)和对照组(N=6),两组大鼠均切除75%的小肠,空肠近端及回肠末端各保留约10 cm,空回肠以7-0吻合线对端吻合,建立短肠综合征大鼠模型。从其右侧颈外静脉置管,连续24小时输注营养液至14天。实验组大鼠予以腹腔注射维生素D3(4μg/kg,1次/d,14d)。分别于术后14天处死大鼠,取部分肝脏组织标本行免疫组化分析,观察肝脏胆汁酸代谢相关蛋白的表达及分布；另取部分肝脏组织标本行western-blot半定量检测VDR、FXR、BSEP、OSTα/β、CYP7A1及NTCP蛋白的表达；取部分小肠组织标本行western-blot半定量检测VDR、FXR、ASBT及OSTα/β蛋白的表达。结果：实验第14天,western-blot结果显示实验组大鼠肝脏VDR、FXR、BSEP、 OSTα及OSTβ蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05),而实验组大鼠肝脏CYP7A1和NTCP蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。与此同时,实验组大鼠小肠VDR、FXR、OSTα及OSTβ蛋白表达也显著高于对照组(P<0.05),而实验组大鼠小肠ASBT蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。肝脏免疫组化结果同样显示,实验组大鼠肝脏BSEP、OSTα及OSTβ蛋白表达均显著高于对照组,而CYP7A1和NTCP蛋白表达显著低于对照组。结论：维生素D3可显著上调接受长期肠外营养的短肠综合征大鼠肝脏BSEP、 OSTα、OSTβ,以及小肠OSTα、OSTβ蛋白的表达,抑制肝脏CYP7A1、NTCP,以及小肠ASBT蛋白的表达,从而调节胆汁酸代谢,改善肠衰竭相关性肝损害大鼠的肝功能。