哈茨木霉cbh1基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gmgan
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餐厨垃圾是城市生活垃圾的主要成分,餐厨垃圾的主要成分主要包括淀粉类食物、植物纤维、动物蛋白和脂肪,以及碳水化合物等。而由于餐厨垃圾中的纤维素的外部被木质部包被且不溶于水的特点,因此,很难将纤维素水解为小分子单糖等物质,对于纤维素的利用率及降解效率也极低。纤维素酶作为可将纤维素降解的一类酶,主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。然而由于天然纤维素酶对于纤维素的降解能力低且提取纤维素酶的成本较高,故利用基因工程技术构建纤维素酶高产菌株的方法应运而生。酵母表面展示系统作为微生物表面展示技术的一种,可将目的蛋白展示于酵母细胞的表面,能够独立完成蛋白质的翻译后修饰,作为真核表达系统,具有成熟的蛋白分泌和表达机制。因此,凭借其明显的优势,取得了广泛的应用。本研究以实验室保存的哈茨木霉T88做为出发菌株,根据NCBI数据库中相关序列设计引物,经PCR扩增得到1484bp的纤维素外切葡聚糖酶cbh1基因,经检测,该基因无内含子,将目的基因与质粒载体连接,成功构建重组质粒pYD1-cbh1,将重组质粒pYD1-cbh1转化到酿酒酵母EBY100感受态细胞中,在筛选培养基中培养3d左右,得到阳性转化子,最后将阳性转化子接种至半乳糖培养基中诱导表达96h,通过对表面展示目的蛋白的浓度测定及酶活测定,得到在诱导48h时,表面展示酶的活性最高。通过对酿酒酵母表面展示的纤维素外切葡聚糖酶的酶学特性研究,结果表明:反应的最适温度是50℃;最适pH值是5.0,pH在4.0~6.0之间酶活保持相对稳定;10min为最佳的酶与底物反应时间;通过测定金属离子对酿酒酵母表面展示纤维素外切酶酶活的影响,发现Ca2+、 Mn2+在终浓度1.0mM时对酶的活性有促进作用,Cu2+、Zn2+和Fe2+在终浓度5.0mM时对酶的活性有促进作用,而Ca2+、Fe3+和Ag+在终浓度5.0mM时对酶的活性有抑制作用;且经研究发现,表面展示酶的储存稳定性和遗传稳定性良好,对餐厨垃圾中纤维素的降解具有一定的理论和指导意义。
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