流感是一种由流感病毒引起的传染性极强的呼吸系统疾病,由流感引发的病毒性肺炎严重威胁着人们的生命和健康安全。因为流感病毒具有极高的变异性,很容易造成季节性甚至世界范围的大流行,其高发病率和高死亡率引起全世界的关注。目前已经上市的抗流感病毒药物主要有以金刚烷胺、金刚乙胺为代表的M2通道阻滞剂和以奥司他韦、扎那米韦为代表的NA抑制剂,因为药物潜在的毒副作用及耐受性的产生,抗病毒药物的使用存在一定的局限性。因此,寻找新的毒副作用小且有效的抗病毒药物是非常有必要的。本课题的研究目的是通过对系列丁烯内酯类化合物筛选,找到毒副作用小且抗病毒活性高的化合物,并进行活性评价及潜在抗病毒机制探索。首先,我们通过MTT和CPE相结合的方法,对91个丁烯内酯类化合物进行了活性筛选。测定化合物对MDCK细胞的半数抑制浓度CC₅₀,然后用100TCID₅₀检测化合物的抗病毒活性并测定了化合物的半数有效剂量EC₅₀,计算治疗指数SI。通过与利巴韦林的CC₅₀、EC₅₀及SI值比较,筛选出细胞毒性小,抗病毒活性高,治疗指数大,抗病毒潜力优于利巴韦林的化合物。其次,通过体外抗病毒实验,对筛选出的化合物进行体外活性评价及抗病毒机制初步探索。分别在感染病毒前、感染病毒时和感染病毒后加入化合物,测定化合物抗病毒作用的阶段;在加入化合物48h后,通过流式细胞术检测化合物对病毒感染后细胞凋亡的影响;通过NA抑制剂筛选试剂盒,检测化合物对病毒NA的抑制作用,进一步验证化合物对病毒复制的影响。最后,通过建立小鼠感染模型,对化合物进行体内活性评价并进一步探究化合物的抗病毒作用机制。采用随机分组法将小鼠分为7组,分别为正常组、病毒组、利巴韦林组、奥司他韦组及化合物高、中、低剂量组;滴鼻感染病毒2 h后灌胃给药,每天给药一次,连续给药五天。每天观察、检测并记录小鼠的体温、体重及症状变化情况;分别在感染病毒后第1、3、5天收集血样及肺组织,用ELISA和qRT-PCR检测相关细胞因子变化;在感染病毒后第5天取肺组织的同时称量肺重,计算肺指数和肺指数抑制率;用HE染色观察肺组织病理变化;免疫组化检测病毒NP蛋白的表达;qRT-PCR检测病毒载量的变化。实验结果显示,在91个丁烯内酯类化合物中,化合物Ⅴf的细胞毒性小,抗病毒活性高,治疗指数大,抗病毒潜力优于利巴韦林和其他化合物;通过三种不同的加药方式,发现Ⅴf具有预防和治疗作用,直接阻断作用不明显,主要作用于病毒复制的后期,可以抑制病毒感染后引起的细胞凋亡,降低NA的活性,减少子代病毒的释放,从而发挥抗病毒作用;在动物感染模型中,Ⅴf可以明显改善病毒感染引起小鼠厌食、呼吸加重、行动迟缓的症状,减少病毒感染后体重的降低,使小鼠体温维持在正常水平,抑制病毒感染引起的肺指数升高,减轻肺组织出血和炎性病变,减少肺组织中病毒NP和M蛋白的表达,降低肺组织中的病毒载量;通过提高血浆中IgG抗体水平,减少TLR3、RIG-I和IRF3的水平,上调抑炎性细胞因子IL-10和IL-13的表达,下调促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-8的表达,减少iNOS引起NO过量产生等途径发挥抗炎和免疫调节作用,减轻肺部炎性反应,保护肺损伤。因此,Ⅴf对甲型流感病毒感染具有较好的治疗作用。