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血小板是从骨髓成熟巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质,它对机体的止血和凝血功能极为重要。机体生成血小板的过程可以分为巨核细胞生成（megakaryopoiesis）和血小板生成（thrombopoiesis）两个过程。造血干细胞分化发育为成熟巨核细胞的过程称为巨核细胞生成,而血小板生成则指的是成熟巨核细胞进一步生成血小板的过程。血小板生成素（thrombopoietin,TPO）是促进血小板生成的最重要调控因子,它与巨核细胞表面TPO受体（MPL）结合,随后激活PI3K-AKT、MAPK和ERK1/ERK2等信号通路,由此来促进巨核细胞和血小板的发育。除TPO以外,一些细胞因子也对巨核细胞发育和血小板生成有调控作用。例如,GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-9、IL-11、SDF-1、FGF-4和EPO等因子促进巨核系发育,而PF4、CXCL5、CXCL7和CCL5等因子则抑制这一过程。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）是哺乳动物体内唯一可以降解硫酸乙酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）上硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）侧链的内切糖苷酶。在很多肿瘤组织中,HPA的表达明显增加,并通过降解细胞表面和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的HSPGs促进肿瘤的侵袭与转移。生理情况下,HPA在人类血小板中大量表达,提示HPA在血小板发育过程中逐渐表达并可能发挥调控作用。本研究在细胞水平和动物水平探讨了HPA对巨核系分化的调控作用。我们首先利用白血病细胞系（K562、HEL细胞）和原代细胞（脐带血CD34+细胞）分析了HPA在巨核系发育过程中的表达规律,发现巨核系发育过程中上调的HPA可以促进巨核细胞的分化和血小板的生成,然后对其机制进行了深入探究。在此基础上,我们利用HPA过表达的转基因小鼠（Hpa-tg）证实了HPA在体内对巨核系造血的促进作用。所获得的主要研究成果与结论如下:1.HPA在血小板发育过程中表达量逐渐增多。建立了K562、HEL细胞系和脐带血（umbilical cord blood,UCB）CD34+细胞向巨核细胞分化的模型,利用q RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光染色技术研究了HPA在巨核系发育过程中的表达规律,发现HPA在此过程中的蛋白表达量从无到有、从少到多,与巨核系的发育同步。2.HPA能够调节巨核细胞细胞膜上的HSPGs。构建了过表达和敲除HPA的K562、HEL细胞系,然后利用流式细胞术检测细胞分化前后细胞表面HS的变化,实验结果表明在巨核细胞分化过程中,HPA能够促进细胞膜上HSPGs的释放。3.HPA促进巨核细胞的分化。利用流式细胞术和q RT-PCR实验分析了巨核细胞分化标志物CD41的表达,同时对多倍体形成进行分析,结果证明过表达HPA促进巨核细胞CD41的表达,并促进多倍体形成,而敲除HPA则减缓分化。4.HPA促进巨核细胞分泌interleukin 6（IL-6）,进而增强STAT3信号通路。利用ELISA实验筛选了十几种和巨核细胞分化相关的肝素结合蛋白（heparin-binding proteins,HBPs）,发现过表达HPA极大促进IL-6的表达和分泌,而HPA抑制剂则抑制IL-6的表达和分泌,在HPA敲除细胞系中IL-6则显著下调。Western blot结果显示,上调的IL-6可显著增强STAT3信号通路,进而促进巨核细胞的分化。此外,HPA在原代细胞水平也可通过增强IL-6的分泌促进巨核系的分化。5.HPA通过其内切糖苷酶活性促进巨核细胞IL-6转录活性的增强。构建了过表达HPA酶活性缺失的K562细胞系,然后检测其IL-6的分泌量和转录情况,发现其IL-6的转录和分泌量恢复至正常水平,说明HPA的内切糖苷酶活性是其促进IL-6转录和分泌的根本原因。6.Hpa-tg小鼠巨核细胞和血小板生成增多。基于以上结果,我们利用HPA过表达转基因小鼠（Hpa-tg）进行了动物水平的研究。结果显示,相比较于Ctr小鼠,Hpa-tg小鼠骨髓、脾脏和肺脏的巨核细胞数量明显增多,血常规结果也显示Hpa-tg小鼠较Ctr小鼠外周血血小板数量显著增多。7.HPA上调小鼠肝脏IL-6,进而促进TPO的生成。q RT-PCR结果证实HPA同样可以提高小鼠肝脏IL-6 m RNA水平,而Western blot结果进一步证实了肝脏IL-6的上调可以促进其合成TPO,ELISA实验结果也显示Hpa-tg小鼠的血浆TPO水平明显高于Ctr小鼠。综上所述,本项研究首次揭示了HPA在巨核系发育过程中的表达规律,并在细胞水平和动物水平发现了HPA对巨核系分化和血小板生成的促进作用,建立并证实了巨核细胞发育过程中HPA/IL-6/STAT3的正反馈环路作用机制。这一结果提示HPA在巨核细胞和血小板发育过程中占有特殊的地位,为治疗血小板相关疾病提供了新思路。