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糜蛋白酶是一种来源于脊椎动物的消化酶，在治疗消炎和抗癌方面具有良好的药用价值。本研究以青海大通牦牛胰脏为原料，采用单因素试验和响应面分析法Box-Behnken试验方法对缓冲液浸提、超声波萃取、ChTRP活化工艺进行优化，获得糜蛋白酶提取的最佳工艺参数；并通过单因素试验对PVS精提工艺进行优化，进一步提高其酶活，同时对纯化后的酶采用SDS-PAGE及分子量的鉴定；最后对鉴定的酶进行部分特性的研究。主要研究结果如下：(1)提取剂筛选：选取五种不同的提取剂浸提牦牛胰脏组织匀浆，通过单因素试验优化得到以0.002mol/LTris-HCl作为浸提缓冲液的浸提效果最佳时，酶活力为106.5U/mL，是以异丙醇和水浸提所得酶活力的2倍。(2)浸提工艺单因素优化：选取不同的Tris-HCl缓冲液浓度、肉样与缓冲液体积比和浸提温度进行单因素试验，得到最佳Tris-HCl缓冲液浓度为3mmol/L，其酶活为187.9U/mL，最佳肉样与缓冲液体积比为1:3，其酶活为180.5U/mL，最佳浸提温度为5℃，其酶活为190.5U/mL。(3)浸提工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：浸提缓冲液浓度＞浸提温度＞肉样与缓冲液体积比，且影响均呈正效应。最佳缓冲液浸提工艺为：浸提缓冲液浓度为4.0mmol/L、缓冲液与肉样体积比为3.0、浸提温度为5℃。在此最优工艺条件下，牦牛胰脏中糜蛋白酶活力为203.7U/mL。(4)超声波萃取工艺单因素优化：选取不同萃取功率、萃取时间和萃取温度进行单因素试验，得到最佳萃取功率为700W，其酶活为216.6U/mL，最佳萃取时间为6min，其酶活为184.8U/mL，最佳萃取温度为5℃，其酶活为160.7U/mL。(5)超声波萃取工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：萃取温度＞萃取功率＞萃取时间，且影响均呈正效应。筛选出最佳工艺参数：超声波萃取功率为755W、萃取时间为7.5min、萃取温度为4℃时，其酶活力为216.3U/mL。(6) ChTRP活化工艺单因素优化：选取不同pH值、Trypsin添加量、活化时间和温度进行单因素试验，得到最佳pH值为8，其酶活为184.5U/mL，最佳Trypsin添加量为0.4mg，其酶活为187.9U/mL，最佳活化时间为120min，其酶活为202.8U/mL，最佳温度为25℃，其酶活为194.2U/mL。(7) ChTRP活化工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素为pH值、Trypsin添加量、活化时间和温度，其影响大小依次为：活化时间、pH值、温度、Trypsin添加量。并通过Box-Behnken响应面试验，以糜蛋白酶活力为指标，筛选出最佳工艺参数pH值为7.4、Trypsin添加量为0.4mg、活化时间为125.9min、温度为32℃时，其酶活力为221.76U/mL。(8) PVS精提：在25℃时，当PVS浓度为0.015mol/L对糜蛋白酶聚合效果最强；当PEI浓度为4.E-06mol/L时，糜蛋白酶聚合物的溶解效果最佳，酶活力达到592.4U/mL，提取率为14.95%。SDS-PAGE鉴定纯度达到电泳纯，分子量约为25ku。酶学特性：最适反应pH值为8.0，在pH值7.5～9.0、18～38℃的条件下糜蛋白酶稳定性最高；金属离子Ca2+、Cu2+、Mn2+、K+、Fe3+、Fe2+、Zn2+对该酶均有不同程度的抑制作用，其抑制率达到0.4%～14%；Km=0.57mmol/L，Vmax=0.0055μmol/min。综上所述，采用缓冲液浸提、超声波萃取、ChTRP活化、PVS聚合纯化技术从牦牛胰脏中将糜蛋白酶分离纯化至电泳纯，该酶具有耐酸耐热性，可被金属离子抑制。本研究具有工艺简单、生产周期短、所制的糜蛋白酶质量高等特点，因此，利用先进的生物分离工程技术进行糜蛋白酶的生产，提高酶的收率及活力，在生化制药业中以及动物副产品综合利用中具有积极的意义。