肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)和艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)是严重威胁人类健康的两大重要疾病。本研究介绍了microRNA (miRNA)在肝癌中的重要作用,揭示miR-34a在肝癌侵袭转移中对基因表达调控的作用机制。同时,为了研制新型的AIDS疫苗,本文也介绍了甲型减毒嵌合流感病毒诱导HIV-1广谱中和抗体的分子机制。1. miR-34a抑制肝癌的侵袭转移肝癌是一种发病率、死亡率均较高的恶性肿瘤,它带有预后不良和远端侵袭转移的特征。虽然肿瘤的侵袭转移是病人高死亡率的主要原因,但是我们对它的分子机制研究还是有限的。对肿瘤侵袭转移方面的研究揭示miRNA在这些过程中的重要作用,因为miRNA能在转录后水平调控与侵袭转移相关的各种关键基因。miRNA是真核生物中一类长度为17–25个核苷酸(nt)的参与基因转录后水平调控的小分子非编码RNA。在动物细胞中,成熟的miRNA与蛋白质一起组成RISC复合体并与它的靶基因mRNA的3′UTR结合,从而引起靶mRNA的降解或翻译的抑制。miRNA能够作为癌基因或抑癌基因在转录后调控肿瘤细胞的增值和凋亡。一方面,致癌性miRNA在肿瘤中常常过表达,比如miR-21,miR-10b,miR-373和miR-520c在肿瘤细胞中过表达后诱导肿瘤侵袭转移。另一方面,抑癌性miRNA在肿瘤中常常下调表达,例如miR-126*,miR-335,miR146a和miR-29c在肿瘤细胞中下调表达后导致肿瘤的发生、发展和侵袭转移。研究证明,miR-34a是p53的一个直接转录靶,它在各种癌症中经常被删除。miR-34a的下调表达可能是由于肿瘤细胞中p53的失活突变。例如,在成神经细胞瘤中可以观察到miR-34a的表达丧失,它可能是由于染色体1p36区域的缺失,此区域包括miR-34a。此外,在15种胰腺癌细胞中检测miR-34a表达,其中11种miR-34a的表达降低或检测不到。在25例人结肠癌组织中,与癌旁组织相比其中有9例(36%)显示miR-34a的表达下调。最近,miR-34a的靶基因已经被证实,它可以通过调节细胞周期关键基因或凋亡抑制因子诱导G1期阻滞,细胞凋亡和细胞衰老,这些靶基因包括CDK4/6、cyclin E2 (CCNE2)、cyclin D1 (CCND1)、E2F3、Bcl-2和MYCN。有趣地是,miR-34a也直接抑制癌基因酪氨酸激酶受体c-Met的表达。c-Met是肝细胞生长因子HGF的受体,它具有自主磷酸化活性的功能。HGF刺激的c-Met激活作用引发它的信号转导途径中的分子磷酸化,比如ERK1/2,这个关键因子影响肿瘤的侵袭转移。的确,c-Met蛋白参与细胞的离散,侵袭和转移。这些证据表明miR-34a也可能具有调节侵袭转移的作用。在本论文中,我们证明在肝癌组织和肝癌细胞系HepG2中,miR-34a可以通过靶向与侵袭相关的c-Met基因调节细胞的离散,侵袭和转移。此外,我们也在肝癌组织中确定并讨论了miR-34a和c-Met的表达水平和可能的生物学功能。本论文的研究证明,miR-34a的重要作用是通过抑制c-Met癌基因的表达从而调节肝癌细胞的离散,侵袭和转移。我们利用qRT-PCR技术对25例肝细胞癌病人的癌组织和癌旁组织中的miR-34a表达进行了检测,发现与癌旁正常组织相比,miR-34a在19例肝癌组织(76%)中表达下调,并且这与肿瘤的侵袭转移有密切关系。此外,在肝癌样本中miR-34a的明显下调与c-Met蛋白的表达,两者呈负相关。在肝癌细胞系HepG2中,miR-34a的过表达有力的抑制肿瘤细胞的离散,侵袭和转移;它直接靶向c-Met癌基因并且同时减少c-Met的mRNA和蛋白表达水平;因此在c-Met信号途径中,它也减少了c-Met诱导的ERK1/2的磷酸化水平。总之,我们的研究证明了miR-34a全新的生物学功能,它能在肝癌细胞系HepG2中抑制肿瘤的离散、转移和侵袭。同时我们也揭示了在肝癌组织中miR-34a的下调表达与c-Met蛋白上调表达呈负相关性。本论文涉及引入miR-34a的策略抑制c-Met蛋白表达,干扰HGF/c-Met信号转导途径,从而抑制肝癌细胞的侵袭转移,这为肝癌及其它肿瘤的基因治疗提供了理论基础。2.甲型减毒嵌合流感病毒诱导HIV-1广谱的中和抗体人类流感病毒是一种被人们关注的全球性的传染疾病。因此选择一种用来繁殖流感病毒的细胞系对于生产流感疫苗是非常必要的。Vero细胞已经30多年被广泛的用于人类疫苗生产,它是唯一连续传代的被权威机构所接受的用来生产全病毒疫苗的细胞系。甲型和乙型流感病毒通过红血球凝聚素(HA)蛋白与宿主细胞表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸寡糖结合。人类流感病毒优先结合α2,6-连接的唾液酸(NeuAcα2,6Gal),而禽流感病毒主要结合α2,3-连接的唾液酸(NeuAcα2,3Gal)。虽然Vero细胞表面存在NeuAcα2,6Gal,但是它的含量没有人类气管上皮细胞中的含量高,所以导致人类流感病毒不适合在Vero细胞中生长。在本研究中,我们稳定地转染Vero细胞用人类2,6-唾液酸转移酶(SIAT1)的cDNA,它的产物催化糖蛋白上的半乳糖α2,6-唾液酸化作用。Vero细胞被带有SIAT1的cDNA和新霉素抗性基因的质粒转染,并且被G418硫酸盐筛选。稳定转染后,通过Western blot和免疫荧光显微技术证明,在Vero-SIAT1细胞中过表达SIAT1基因。通过SNA和MAA染色方法表明,与亲本的Vero细胞相比,Vero-SIAT1细胞分别表达7倍高量的NeuAcα2,6Gal和3倍低量的NeuAcα2,3Gal。此外,甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和乙型流感病毒在Vero-SIAT1细胞中繁殖具有更高的病毒滴度。Vero-SIAT1细胞系不仅有利于繁殖人类流感病毒,而且也为提高甲型减毒流感病毒的产量提供细胞基质。人类免疫缺陷病毒- 1 (HIV-1)包膜蛋白gp41保守的膜近外侧区(membrane-proximal external region, MPER)是两个广谱的中和抗体2F5和4E10的作用靶点,2F5和4E10这两个抗原表位对于艾滋病疫苗的设计起着至关重要的作用。本课题试图使用甲型减毒嵌合(包括2F5/4E10抗原表位)流感病毒作为载体在动物体内诱导抗体。减毒流感病毒具有以下一些优点:首先,它能通过鼻腔进行免疫并产生粘膜免疫反应;其次,流感病毒表面具有更多的HA蛋白,增加了与BCR的相互接触;最后,与HIV-1病毒膜融合类似,流感病毒在进入细胞时也改变自身构象完成此过程。为了增强这些抗原表位的暴露和发展AIDS疫苗成分,本课题构建了甲型减毒嵌合流感病毒载体库,即通过分子克隆的方法将HIV-1的MPER (NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK)、2F5 (ELDKWA)或4E10 (NWFNIT)抗原表位替换至甲型流感病毒HA的MPER (IDGVKLESMGVYQ)的对应区域。在研究中,共构建了17个嵌合流感病毒载体,其能够在HEK293T+Vero细胞中包装并产生有感染性子代病毒。选取其中2个包装效率高的甲型减毒嵌合流感病毒,分别是Flu-HIV-MPER (含2F5和4E10抗原表位)和Flu-HIV-4E10-3 (含4E10抗原表位)作为疫苗。RT-PCR和Western blot实验证明Flu-HIV-MPER和Flu-HIV-4E10-3的减毒性和抗原表位。用不同的甲型减毒嵌合流感病毒单独免疫豚鼠或用含2F5/4E10分支肽初免-甲型减毒嵌合流感病毒加强免疫豚鼠,来考察诱导广谱中和抗体的能力。ELISA检测和中和抗体检测结果显示,Flu-HIV-MPER或Flu-HIV-4E10-3不同的甲型减毒嵌合流感病毒单独免疫豚鼠后血清中可以产生针对2F5或4E10抗原表位的抗体,具有较高的结合抗体滴度,并且血清50%中和HIV-1的SF162(B)、SC19-15(BC)、11018(BC)和YN78-8(BC)假病毒的滴度范围是107～132。此外,2F5/4E10分支肽初免-相应的甲型减毒嵌合流感病毒加强免疫后,Western blot结果说明豚鼠血清中产生了类似2F5或4E10抗原表位的抗体;ELISA检测结果说明在豚鼠血清中诱导出了比较强的免疫应答。HIV-1中和抗体检测结果表明,不同的分支肽可以诱导产生针对B/BC亚型HIV-1假病毒的中和抗体,嵌合流感病毒可以加强中和抗体的能力,血清50%中和HIV-1的SF162(B)、SC19-15(BC)、11018(BC)和YN78-8(BC)假病毒的滴度范围是90～350。总之本课题首次以甲型减毒嵌合流感病毒为免疫原免疫豚鼠诱导出广谱的HIV-1中和抗体,虽然中和活性相对较弱,但为发展有效的AIDS疫苗提供了新的思路。