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A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的核糖核蛋白（vRNP）复合体在感染病毒细胞内完成病毒基因组的转录和复制依赖于vRNP与宿主蛋白的相互作用。研究vRNP与宿主蛋白的相互作用,不仅有助于进一步阐明流感病毒转录和复制的分子机制,而且可以发现来源于宿主系统的抗病毒药物靶标,为抗流感病毒药物的研发提供新的思路。本研究利用亲和纯化结合质谱分析（AP-MS）的方法鉴定到80个与vRNP相互作用的宿主蛋白。其中,细胞生长调控核仁蛋白（Cell growth regulating nucleolar protein,LYAR）被证明在IAV复制中起重要作用。进一步研究表明LYAR与vRNP结合并促进vRNP组装,进而促进病毒RNA的合成,而LYAR在此过程中发挥作用需要它的核定位以及215和244位的丝氨酸磷酸化,并且LYAR的磷酸化受到IAV感染激活的蛋白激酶C（PKC）的调控。另一方面,LYAR还通过靶向干扰素调节因子3（IRF3）抑制β干扰素（IFN-β）的产生,从而抑制抗病毒天然免疫反应,促进病毒复制。主要内容如下:1.鉴定vRNP相互作用的宿主蛋白本研究利用Flag-PB1纯化重组的H1N1/PR8病毒的vRNPs,并通过质谱鉴定得到80个潜在的vRNP相互作用的宿主蛋白。接下来的研究聚焦于鉴定到的核仁蛋白,并对其中5个候选蛋白（LYAR、PPP1CA、HNRNPR、MCDRH和RPL19）进行筛选,发现沉默LYAR对IAV复制和聚合酶活性的抑制作用最为显著,因此,对LYAR与vRNP的相互作用进行了深入研究。2.LYAR与vRNP相互作用Co-IP实验结果表明LYAR与RNP的所有亚基（PB1、PB2、PA和NP）在共表达细胞中存在相互作用,并且LYAR通过其C端富含赖氨酸的区域与重组的vRNP结合。进一步,在病毒感染的A549细胞中证明了 LYAR与RNP亚基的相互作用,表明LYAR与RNP亚基在病毒感染中存在真实的相互作用。此外,在共表达的情况下,LYAR与PB1、PB2和NP在细胞核仁共定位,而与PA在核质中共定位,但是在病毒感染的情况下,LYAR与NP在核质和胞质中共定位,表明IAV感染导致LYAR定位发生改变,提示LYAR可能在IAV的转录和复制或vRNP核输出中起作用。3.LYAR促进病毒RNA的合成检测LYAR对IAV复制的影响,结果显示由siRNA和CRISPR/Cas9分别介导的LYAR敲低和敲除均显著地抑制H1N1和H5N1流感病毒的复制,表明LYAR对IAV复制的重要性。进一步探究LYAR调控病毒复制的作用机制,发现沉默和过表达LYAR分别显著抑制和促进病毒RNA和蛋白的合成。进一步的研究表明LYAR不影响病毒的初级转录,但是促进病毒基因组的复制。在此基础上,考察LYAR对聚合酶活性和vRNP组装的作用,结果表明LYAR促进vRNP组装,进而调控病毒基因组的复制。4.LYAR的NLSs以及S215和S244的磷酸化对IAV复制起重要作用通过鉴定LYAR调控病毒复制的关键区域和位点,发现位于LYAR C端的核定位信号（NLSs）和丝氨酸磷酸化位点（S215和S244）在LYAR调控IAV复制中起关键作用。缺失LYAR NLSs以及S215和S244发生去磷酸化突变导致LYAR促进病毒复制的能力显著下降,而模拟磷酸化形式则显著增强,表明IAV复制需要LYAR的NLSs以及S215和S244的磷酸化。同时,LYAR的核定位受到S215和S244磷酸化的调控。5.PKC调控LYAR的核定位和IAV复制本研究利用Netphos3.1预测到PKC是磷酸化LYAR S215的激酶,并通过实验进行了验证。鉴于LYAR磷酸化对其核定位和病毒复制的重要性以及S215的磷酸化受到PKC的调控,下一步考察了 PKC对LYAR定位和IAV复制的影响。利用PKC的激动剂（TPA）和抑制剂（BIM）进行实验,发现TPA处理后LYAR定位于核仁,而BIM处理导致LYAR部分胞质滞留,说明LYAR进入细胞核依赖于其被PKC调节的磷酸化。利用相同的方法检测PKC对病毒复制的调控,结果显示,TPA促进IAV的RNA合成、聚合酶活性、vRNP组装和病毒复制,而BIM则起抑制作用。至此,我们揭示了 LYAR有效地进入胞核和IAV的有效复制都需要LYAR的磷酸化,且受到PKC的调节。结合IAV感染后诱导LYAR的磷酸化这一发现,得出以下结论:IAV感染激活PKC,导致LYAR的磷酸化,反过来LYAR促进病毒的复制。6.病毒诱导的IFN-β促进LYAR的表达IAV、Sev和VSV感染或poly（I:C）刺激A549细胞后,LYAR的mRNA和蛋白水平均显著上调,并且IFN-β直接处理A549细胞导致LYAR的表达量显著增加,而Sev刺激IFN-I缺陷型的Vero细胞后LYAR的表达并没有发生明显改变,表明IFN-β在病毒感染中促进LYAR的表达,提示LYAR在抗病毒天然免疫反应中的潜在作用。7.LYAR通过靶向IRF3负调控抗病毒天然免疫反应本研究显示LYAR显著抑制IFN-β、ISGs和炎性细胞因子的表达。进一步发现LYAR抑制Sev诱导的IFN-β、ISRE和NF-κB的启动子活性。在此基础上,通过分析LYAR对RIG-I介导的IFN-β诱导通路的影响,发现LYAR通过靶向IRF3抑制IFN-β的产生。接下来探究LYAR抑制IRF3介导的IFN-β转录的机制。研究表明,LYAR对IRF3的磷酸化和入核均无明显作用,但是,LYAR与磷酸化的IRF3相互作用,阻碍IRF3与ISRE的结合,并且不影响IRF3与CBP/P300的相互作用。因此,LYAR通过抑制IRF3的DNA结合能力来调控IFN-β的产生。总之,本研究鉴定到许多潜在的与vRNP相互作用的宿主因子,并进一步阐明了核仁蛋白LYAR与vRNP相互作用促进IAV复制的机制,不仅加深了对IAV转录和复制分子机制的认识,而且揭示了 LYAR在细胞内的新功能。