卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而高居第三位。但因其缺乏早期特异性症状以及有效的筛查手段,70%的病人在首次就诊时已是晚期,治疗难度大、复发率高、转移快,是女性生殖系统恶性肿瘤死亡率最高的肿瘤。手术治疗和以紫杉醇、顺铂等为主的联合化疗方案一定程度上改善了患者的预后,但治疗过程中产生的化疗耐药令卵巢癌的5年生存率始终徘徊在30-40%左右,是妇科肿瘤医生和研究人员面临的严峻挑战。肿瘤的多药耐药(Multi-drug resistance,MDR)是指肿瘤细胞在接触一种抗肿瘤药产生耐药性后,对未接触过的、结构不同、作用机制各异的其他抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。肿瘤的多药耐药机制产生复杂,一个重要原因就是转运体P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)细胞内药物外排。P-gp利用细胞内的三磷酸腺苷(ATP)将多种细胞毒性药物排出细胞外,增加了肿瘤细胞对药物的抵抗性,从而使肿瘤细胞耐药。多年来,围绕MDR1/P-gp为靶标的逆转耐药研究,包括使用P-gp的竞争性抑制剂、单克隆抗体、反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术等开始崭露头角,但多药耐药的形成是一个多基因、多因素的复杂的过程,靶向治疗涉及的非特异性、副作用、安全、经济等问题限制了其应用。因此探索新的逆转肿瘤多药耐药的途径、逆转耐药成为卵巢癌治疗的热点和难点。我国传统中医药博大精深,近年来,从传统中药及天然植物中提取的多种抗肿瘤成分已被证实为有效的抗肿瘤制剂。柚皮苷(Naringin)全称为柚皮素新橙皮糖苷,是一种双氢黄酮类化合物,主要存在于芸香科植物,如柚子、葡萄柚、酸橙及其变种的果皮中,具有资源丰富、化学结构清晰、原材料价格低廉的优势。现有研究表明,柚皮苷具有抗癌、抗炎、预防动脉粥样硬化等药理作用。与其他黄酮类化合物一样,柚皮苷也具有抗肿瘤作用,对常见的肿瘤如乳腺癌、结肠癌、膀胱癌及肝癌等均具有有效的抗癌作用,在妇科恶性肿瘤中的研究尚少见。本课题组的前期结果提示:柚皮苷能明显抑制人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞体外增殖,且随着药物作用时间的延长和浓度增大,柚皮苷对卵巢癌增殖抑制率逐渐增大。进一步研究显示:柚皮苷对人上皮性卵巢癌耐顺铂(DDP)细胞株SKOV3/DDP细胞的体外增殖亦具有明显抑制作用,并能增强SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,其逆转耐药的机制可能与下调多药耐药基因MDR1及多药耐药相关蛋白MRP2基因的表达有关,为证实柚皮苷在卵巢癌抗肿瘤及逆转顺铂耐药性的作用提供了初步的思路。近年来研究显示,核转录因子-κB(nuclear factor-κappa B NF-κB)与肿瘤的发生、发展、转移均有密切的关系,它所编码的许多蛋白能促进肿瘤生长;顺铂耐药卵巢癌细胞中NF-κB持续高表达,且其在卵巢癌细胞耐药机制中处于核心地位;NF-κB通过调节下游靶蛋白Bcl-x L、Bcl-2、Fas/Fas L、XIAP、survivin、c IAP1/2、CDK2、VEGF、COX-2等发挥抗凋亡作用,令肿瘤细胞生存能力增强,最终导致化疗耐药。NF-κB信号通路作为一种与肿瘤发生发展密切相关的信号通路,结论亦得到了多项支持。基于前期研究,本实验继续拟以人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP为研究对象,初步探讨柚皮苷对卵巢癌细胞的作用和相关机制,以及逆转顺铂耐药的相关信号通路调节机制,为临床逆转卵巢癌化疗耐药提供理论依据。第一部分:柚皮苷对卵巢癌细胞增殖的影响及体外逆转SKOV3/DDP细胞的耐药性目的:观察柚皮苷对体外培养的人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP增殖的影响,观察柚皮苷体外逆转SKOV3/DDP耐药性的作用。方法:1、细胞培养:SKOV3及SKOV3/DDP细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI l640完全培养基,置于37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养,隔日换液,2~3天传代一次。2、MTT法检测SKOV3及SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性:取对数生长期细胞,接种于96孔培养板,细胞密度为5×103,实验组两种细胞分别加入不同浓度的顺铂(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml),对照组加入不含药物的RPMI1640培养基,培养48h后,MTT法测定各孔的OD值,计算各浓度组的细胞增殖抑制率和半数抑制浓度IC50,并用公示计算SKOV3/DDP细胞的耐药指数。3、MTT法检测柚皮苷对SKOV3/DDP细胞增殖性的影响:取对数生长期细胞,常规胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液制成单细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔100μl(含约5×103个细胞),待细胞贴壁后去培养液并加入不同浓度柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L),每组设5个复孔,分别培养24h、48h、72h,设对照组。根据测得的吸光度(OD)值,计算不同时间作用下两组不同浓度细胞的生长抑制率。规定生长率大于90%的药物浓度为该药的非细胞毒性剂量,确定柚皮苷的最佳作用浓度和作用时间。4、MTT法检测柚皮苷对SKOV3/DDP细胞耐药性的逆转:取对数生长期细胞,接种于96孔培养板,细胞密度为5×103,对照组加入不同浓度的顺铂(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml),每组设5个复孔,实验组在对照组基础上加用终浓度为20μmol/L的柚皮苷,培养48h后,计算各组的细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度IC50、逆转倍数,以判定柚皮苷是否能逆转卵巢癌耐药细胞株的耐药性。结果:1、MTT结果显示:不同浓度的DDP(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)作用于两组细胞后,SKOV3细胞的IC50为8.618,SKOV3/DDP的IC50为18.876,耐药倍数为2.190,说明SKOV3/DDP是具有DDP耐药性的耐药细胞。2、MTT结果显示:不同浓度的柚皮苷均能抑制SKOV3/DDP细胞的增殖,这种抑制作用随着药物作用浓度的升高(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)和作用时间的延长(24h、48h、72h)而明显增加,呈现浓度-时间依赖性;柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用于SKOV3/DDP细胞24h后的增殖抑制率为:3.05±0.15%、3.89±0.44%、11.67±0.53%和22.38±0.63%,20μmol/L和10μmol/L组间差异无统计学意义;作用48h后,增殖率分别为4.14±0.21%、7.49±0.62%、28.81±1.22%和36.49±1.14%,不同浓度柚皮苷组间差异有统计学意义(P<0.05),72h后,不同浓度柚皮苷组间差异有统计学意义(P<0.05),40μmol/L的柚皮苷48h和72h差异无统计学意义(P>0.05),为避免实验过程中细胞死亡过多,我们选取柚皮苷20μmol/L作用48h作为研究逆转SKOV3/DDP细胞耐药性的最适宜浓度和作用时间。3、随着DDP浓度的增加,20μmol/L的柚皮苷作用48h后,SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率也逐渐增加,分别为8.09±0.47%、17.49±1.30%、25.40±1.10%、41.31±2.34%、71.06±2.12%、83.90±1.15%,实验组的SKOV3/DDP细胞的IC50为:9.112μg/ml,对照组的IC50为:18.876μg/ml,差异有统计学意义(P﹤0.05);20μmol/L剂量柚皮苷的逆转倍数为:2.072。结论:1、不同浓度的柚皮苷单独或联合应用DDP对SKOV3及SKOV3/DDP细胞的体外增殖均有抑制作用,并具有时间-剂量依赖性。2、非细胞毒性的柚皮苷联合DDP可提高其体外抗卵巢癌作用,部分逆转SKOV3/DDP细胞的耐药性。第二部分:柚皮苷体外逆转SKOV3/DDP耐药性的作用机制目的:探讨柚皮苷体外逆转SKOV3/DDP细胞耐药性的相关分子机制。方法:1、P-gp在卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP细胞中的表达测定:取对数生长期细胞,细胞密度为5×103,接种于6孔板,培养48h,提取总蛋白,比较SKOV3及SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白的表达差异。2、不同浓度柚皮苷对SKOV3/DDP细胞P-gp蛋白的表达影响:不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)柚皮苷作用于SKOV3/DDP细胞,培养48h后提取总蛋白,测定P-gp蛋白的表达情况,了解单用柚皮苷对SKOV3/DDP细胞P-gp蛋白的影响。3、取对数生长期细胞,选择最佳柚皮苷及DDP的作用浓度和时间,作用于SKOV3/DDP细胞,分为单用柚皮苷组(20μmol/L)、单用顺铂组(5μg/ml)、柚皮苷(20μmol/L)联合顺铂(5μg/ml)组、设对照组,培养48h后,测定P-gp蛋白的表达,以判定柚皮苷逆转顺铂耐药的机理;测定cyclin D1、C-myc、caspase3、caspase7、bcl-2、survivin、MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin蛋白的表达,以了解柚皮苷通过抑制卵巢癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制卵巢癌细胞侵袭、转移、血管生成等机制,从而逆转耐药的机理。结果:1、SKOV3和SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白的表达:两组细胞培养48小时,Western blotting结果显示:两组细胞均有P-gp蛋白的表达,SKOV3细胞的P-gp蛋白的表达量低于SKOV3/DDP细胞,差异有统计学意义(P﹤0.05)。2、不同浓度柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用于SKOV3/DDP细胞,培养48h后,P-gp的蛋白表达量逐渐降低((4.920±0.142、4.750±0.123、3.123±0.146、1.883±0.114),80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L柚皮苷组较空白对照组相比差异有统计学意义(P﹤0.05)。3、柚皮苷通过下调P-gp蛋白的表达逆转SKOV3/DDP细胞的耐药性:单独柚皮苷组(20μmol/L)、柚皮苷(20μmol/L)联合DDP(5μg/ml)组分别与空白对照组比较,P-gp蛋白表达均明显降低,差异具有统计学意义(P﹤0.05);柚皮苷联合DDP组与单独DDP组比较P-gp蛋白的表达明显降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。4、柚皮苷对SKOV3/DDP细胞凋亡、侵袭相关蛋白的影响:(1)Western blotting结果显示:与空白对照组比较,单独柚皮苷组、柚皮苷联合DDP组的凋亡抑制蛋白bcl-2、survivin的表达均降低,促凋亡蛋白caspase3、caspase7表达升高,差异有统计学意义(P﹤0.05);柚皮苷联合DDP组与单独DDP组比较,bcl-2、survivin表达下降,caspase3、caspase 7表达升高,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。(2)细胞周期调控蛋白cyclin D1、C-myc在柚皮苷及DDP单药组、联合用药组中表达降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05);联合用药组中二者的表达较单用DDP组下降,差异有统计学意义(P﹤0.05)。(3)肿瘤侵袭相关蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin在柚皮苷及单药组、联合用药组中表达降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05);联合用药组中侵袭相关蛋白的表达较单用DDP组下降,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:柚皮苷作用于SKOV3/DDP细胞,通过下调P-gp蛋白的表达、下调凋亡抑制蛋白bcl-2及survivin、上调促凋亡蛋白caspase3及caspase7表达、下调细胞周期调控蛋白cyclin D1及c-myc、肿瘤侵袭相关蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin的表达等多种机制和途径,逆转SKOV3/DDP细胞的耐药性,这可能是柚皮苷逆转顺铂耐药的部分分子机制。第三部分:柚皮苷通过调控NF-κB信号通路逆转SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的作用机制目的:探讨柚皮苷通过调控NF-κB信号通路逆转SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的作用机制。方法:1、RT-PCR及Western blotting方法检测不同浓度柚皮苷对实验室培养的SKOV3/DDP细胞NF-κB基因和蛋白的表达影响。2、设计合成靶向NF-κB的小干扰RNA(si RNA),靶向沉默NF-κB,构建过表达NF-κB重组质粒载体,转染细胞,细胞分组如下:空白对照组(不导入质粒及si RNA)、空载质粒对照组、NF-κB过表达组、si RNA对照组、NF-κB si RNA组。转染NF-κB si RNA及过表达质粒48 h后,RT-PCR及Western blotting检测检测P-gp的m RNA和蛋白表达水平。3、转染NF-κB过表达质粒的SKOV3/DDP细胞中同时进行柚皮苷干预,分组如下:柚皮苷20μmol/L+NF-κB过表达组、柚皮苷20μmol/L+空载质粒对照组。培养48 h后,检测P-gp的m RNA和蛋白表达水平。结果:1、RT-PCR及Westem blotting结果均显示,随着柚皮苷浓度增大,NF-κB的m RNA和蛋白表达逐渐下降,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05);80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L与10μmol/L柚皮苷组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05);但40μmol/L和20μmol/L组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。2、RT-PCR及Westem blotting结果显示,NF-κB过表达组P-gp的m RNA及蛋白表达升高,而si NF-κB组P-gp的m RNA及蛋白量表达降低,与空白对照组、空载质粒及si RNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3、实验组转染过表达NF-κB质粒,对照组转染空载质粒,Westem blotting结果显示实验组NF-κB蛋白表达量较对照组明显升高,提示转染成功。过表达NF-κB后,P-gp的m RNA、蛋白表达量均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:柚皮苷通过抑制SKOV3/DDP细胞中P-gp蛋白的表达从而逆转卵巢癌顺铂耐药,这种逆转作用与NF-κB信号通路的调控相关。