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课题组前期通过芯片技术检测到180日龄大白猪(性成熟,睾丸中有各种类型生精细胞)和60日龄大白猪(睾丸中出现精母细胞)睾丸组织中有129个差异表达的microRNA(miRNA),其中miR-762差异极显著(P<0.01)。ST细胞系为猪睾丸细胞系,是从80到90天胚胎期公猪睾丸中分离获得的一种细胞系,本课题在鉴定ST细胞的基础上,以mi R-762为主要研究对象,探究其在ST细胞增殖和精子发生过程中的功能。此外,为了探究公猪精液品质的改良方法,对相关基因中的分子标记位点在杜洛克猪、大白猪和长白猪公猪群体中进行精液品质性状关联分析,探寻有效的分子标记进行辅助选种。本课题主要研究结果如下:1、通过光学显微镜观察到ST细胞核中存在类似支持细胞核中特有的卫星核小体,推测ST细胞可能为猪睾丸支持细胞;经Feulgen染色和电镜观察,鉴定出ST细胞核中的确存在卫星核小体,表明ST细胞为支持细胞;免疫荧光检测到100%的ST细胞表达支持细胞的标记蛋白ABP和FASL。通过检测60日龄、180日龄大白猪睾丸组织和ST细胞中未成熟支持细胞标记基因KRT18和成熟支持细胞标记基因FSHR的mRNA表达,发现ST细胞只表达KRT18 mRNA,不表达FSHR mRNA,表明ST细胞为未成熟的支持细胞;免疫荧光检测到100%的ST细胞表达未成熟支持细胞的标记蛋白AMH,表明ST细胞为猪未成熟支持细胞。2、通过双荧光素酶报告系统验证了miR-762可与RNF4基因3‘UTR的651bp-677bp位点结合;通过荧光定量PCR和Western blotting检测发现miR-762可抑制ST细胞中RNF4基因的mRNA和蛋白质表达,表明RNF4为miR-762的靶基因。通过RNA22在线网站预测发现RNF4基因3‘UTR内的一个SNP的不同等位基因型使得miR-762与RNF4基因3‘UTR的结合位点数量发生改变,这一预测通过双荧光素酶报告系统得以验证,该SNP与公猪精液品质性状间存在显著关联。通过RTCA xCELLigence系统检测和流式细胞仪检测miR-762对ST细胞增殖、周期和凋亡的影响,结果显示miR-762可以促进ST细胞的增殖,促进ST细胞由DNA合成前期(G1期)向DNA合成期(S期)转变,抑制ST细胞的凋亡。利用相同的技术检测RNF4对ST细胞的影响,结果显示RNF4与miR-762的作用效果相似,说明miR-762不是直接通过RNF4对ST细胞生长产生影响。进一步检测发现mi R-762能够减少ST细胞核中雄激素受体(AR)的水平,且可以降低AR的转录调控活性,而RNF4对AR的作用与miR-762相反。免疫荧光结果显示AR与RNF4蛋白质在ST细胞核内共定位,表明miR-762可能通过作用于细胞核中的RNF4来调控AR的转录调控活性,从而影响ST细胞的生长。通过检测miR-762对DNA损伤标记蛋白γ-H2AX和DNA损伤修复相关基因的作用发现miR-762可以增强ST细胞的DNA损伤修复的能力。3、在杜洛克猪、大白猪和长白猪三个公猪群体中对DAZL、H2AFZ、RNF4、SPAG1、MMP9和NR4A1基因中的7个分子标记位点进行基因型分析,并与公猪精液品质性状进行关联分析,结果显示除了MMP9基因的SNP外,其他6个分子标记均与公猪精液品质性状存在显著关联(P<0.05)。