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细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）及其恢复性是作物杂种优势利用的遗传基础。目前,水稻（Oryza sativa L.）“三系”杂交稻的生产主要依赖于野败型（wild-abortive）细胞质雄性不育及恢复系统（CMS-WA/Rf）。研究表明,恢复基因PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白RF4通过降解CMS-WA不育基因WA352 mRNA水平而抑制细胞质雄性不育,但RF4是如何结合与介导WA352 mRNA降解的分子机理还不清楚。为了深入研究RF4的恢复机理,本研究首先通过酵母双杂交筛选获得RF4的互作因子,并利用Pull-down技术对候选互作因子进行互作验证。其次,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对部分互作因子进行敲除,验证其生物学功能,确定它们与RF4介导水稻野败型细胞质雄性不育育性恢复的关系和机理。本研究获得如下主要结果:1、通过酵母双杂交技术,筛选文库获得10个RF4候选互作蛋白片段。进一步酵母双杂交实验表明:磷酸酯酶TPP243、未知蛋白DUF143和干旱胁迫诱导蛋白Di19的全长蛋白也能与RF4蛋白互作。2、利用体外纯化的融合蛋白开展Pull-down实验,结果证实RF4与TPP243、DUF143和Di19全长蛋白的相互作用。3、研究结果还证实TPP243、DUF143和Di19之间存在两两互作;Di19自身能形成同源二聚体,说明TPP243、DUF143和Di19可能与RF4形成一个恢复复合体。4、TPP243、DUF143和Di19在水稻各组织呈组成型表达。水稻原生质体的亚细胞定位结果显示,TPP243:GFP融合蛋白部分定位于线粒体,DUF143:GFP定位于细胞核,而Di19:GFP定位于线粒体。5、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在Rf4单基因复育系珍汕R5（ZSR5,野败细胞质,细胞核携带rf3rf3Rf4Rf4）中,分别对TPP243、DUF143和Di19进行单基因敲除。得到的tpp243、duf143和di19 T0敲除转化体花粉育性均表现为不同程度的下降,说明TPP243、DUF143和Di19是Rf4恢复途径的相关基因。6、利用qRT-PCR分析tpp243、duf143和di19敲除突变体叶片中WA352表达水平。结果发现,敲除突变体叶片中WA352的表达水平较复育系ZSR5均有明显的上升,表明ZSR5中TPP243、DUF143和Di19与RF4具有协同抑制不育基因WA352水平而恢复育性的功能。通过本研究,本人鉴定了3个与RF4互作的蛋白因子TPP243、DUF143和Di19;证实它们能够形成蛋白复合体。同时利用功能敲除实验,进一步证实了这些蛋白因子参与了RF4的恢复途径,为进一步研究RF4介导育性恢复的分子机制奠定了基础。