【摘 要】
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生育酚(tocopherol)又称维生素E,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,是人体所必需的微量营养素之一.在天然存在的4种生育酚中,α-生育酚的生物活性最高且被人体优
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生育酚(tocopherol)又称维生素E,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,是人体所必需的微量营养素之一.在天然存在的4种生育酚中,α-生育酚的生物活性最高且被人体优先吸收和利用.α-生育酚主要从植物油或其精炼副产品中提取,但大多数主要的植物油普遍存在低α-生育酚和高γ-生育酚(α-生育酚的前体)含量的现象,推测催化该反应的γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)在油料作物种子中活性很低或受到了抑制.为探索利用基因工程方法提高油料作物种子中的α-生育酚水平,采用3′-和5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(命名为BoTMT).该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内的由347个氨基酸组成的蛋白质.序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8﹪~86.5﹪的同源性.半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官等光合作用旺盛的部位中表达,在分子生物学水平上证实γ-TMT表达水平是决定植物器官中α-生育酚含量的关键.为鉴定BoTMT的功能,将BoTMT成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22﹪.在28℃低温条件下获得了占总重组蛋白45﹪的可溶性蛋白.体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚,这为探索通过生物反应器生产α-生育酚提供了可能性.
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