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丙烯酰胺(Acrylamide,AA)主要应用于工业领域,对人或动物具有神经毒性、生殖毒性、遗传毒性和致癌性。近些年来有研究发现含淀粉类的食品在经过高温加工(≥120℃)过程中由于发生了美拉德反应会形成AA。因此,预防和抑制食品中AA对人类造成的损伤是非常必要的。植物化学物质自身具有强生物活性和良好的药用价值而被广泛关注,从水飞蓟中提取的水飞蓟素(Silymarin,SM)作为天然黄酮类混合物的一种,不仅具有强抗炎和抗氧化活性,还对体内AA代谢过程的相关酶系具有抑制作用。故本研究以PC12细胞为神经系统及氧化应激模型,利用体外试验探讨SM预防AA神经毒性的作用及机制,从而为降低食品中AA对人类造成的损害提供新思路,具体如下:(1)MTT(Thiazolyl Blue,MTT)法检测AA对PC12细胞的毒性作用。结果显示,经不同浓度(1.25,2.5,5,10,20 m M)AA孵育12 h、24 h及48 h后的PC12细胞,相比正常培养的细胞,其细胞存活率下降,且与孵育时间和剂量成正相关性。选用5 mM 24 h作为本试验AA染毒的作用浓度和作用时间,此作用条件下细胞的存活率为61%。(2)MTT法检测SM对PC12细胞增殖的影响和SM对AA所致PC12细胞毒性的保护作用。PC12细胞经不同浓度(12,24,48,96,192μg/m L)SM孵育12 h,结果显示,其细胞存活率与无SM作用正常条件培养的细胞相比无统计学上的差异(P>0.05),说明SM对PC12细胞增殖没有影响;PC12细胞先经不同浓度(12,24,48,96,192μg/m L)SM分别作用1.5 h、3 h及6 h,再用5 mM AA作用24 h,结果显示,SM能够提高PC12细胞的存活率,并与剂量成正相关性,且作用时间为3 h时,SM对PC12细胞的保护效果最佳,故本试验选用3 h作为SM的作用时间。(3)倒置显微镜观察SM对AA所致PC12细胞毒性的保护作用发现,SM能够有效的改善AA所致的细胞贴壁率下降。(4)系统评估了SM对AA所致PC12细胞氧化损伤的保护作用。PC12细胞经不同浓度(12,24,48,96,192μg/m L)SM作用3 h后,再用5 mM AA染毒24 h。结果证明,SM能剂量依赖性的降低AA引起的细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的升高,同时提高细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。(5)实时荧光定量PCR法检测PC12细胞内核转录因子Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)的mRNA含量变化。PC12细胞经不同浓度(12,24,48,96,192μg/m L)SM作用3 h后,再用5 m M AA染毒24 h。结果显示,相比对照组(仅AA染毒24 h的PC12细胞),SM提高了细胞内Nrf2,Gpx,GCLC和GCLM的mRNA含量,且与剂量成正相关性。(6)Western blot法检测PC12细胞质内Nrf2、细胞核内Nrf2及胞内Gpx、GCLC和GCLM蛋白的含量。PC12细胞经不同浓度(12,24,48,96,192μg/m L)SM作用3 h后,再用5mM AA染毒24 h。结果显示,SM能够减少细胞质内Nrf2的含量和增加细胞核内Nrf2的含量,同时提高胞内Gpx、GCLC和GCLM蛋白的含量,且皆与SM的浓度呈依懒性。这说明SM可以通过改善Nrf2的转核情况保护PC12细胞免受AA的毒害作用。综上所述,SM可通过上调细胞内与GSH代谢系统相关的Nrf2信号通路,提高GSH的含量,减少细胞内ROS和MDA的生成,从而抑制AA对PC12细胞造成的氧化损伤。本试验结果能够为SM具有神经保护功效提供体外细胞试验支持,同时也为抑制体内AA的毒性提供了新途径。