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根据GenBank登录的MyD88基因序列设计特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及保护碱基。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从长白猪肠系淋巴结组织总RNA中扩增出一条特异性基因片段。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,经菌液PCR和双酶切反应筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明:本试验成功克隆了MyD88基因,由882个核苷酸组成,编码293个氨基酸。将克隆获得的氨基酸序列通过在线软件对MyD88的结构和功能进行生物信息学预测,结果表明:该蛋白在结构上具有3个典型的结构域,N端的死亡结构域,中间的连接结构域和C末端的TIR结构域;并且在MyD88氨基酸序列中发现有3个潜在的O-糖基化位点,无N-糖基化位点;18个潜在的磷酸化位点;3个主要的疏水区;不具跨膜区;其二级结构都主要以无规则卷曲组成。通过与人、牛、大鼠和小鼠同源比对,发现猪MyD88的TIR结构域具有高度的保守性,与人的同源性最高,达98.53%。本研究将MyD88基因定向克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组融合表达质粒子pET32a-MyD88,转化至E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,优化表达条件,并初步纯化重组融合蛋白。结果表明:MyD88基因在重组融合表达质粒pET32a(+)中的插入方向和读码框均正确:MyD88基因已在Ecoli BL21(DE3)中实现了融合表达,表达的融合蛋白分子量约为53.6KDa。首次成功利用大肠杆菌表达体系表达出猪MyD88蛋白,其表达量占菌体总蛋白的19.38%,并且对表达条件进行了优化,其表达量达23.22%;诱导2h后pET32a-MyD88融合蛋白的表达量达到峰值。通过固定相粒子亲和色谱(IMAC)方法纯化重组融合蛋白,其中咪唑浓度为300mmol/L的Elution buffer的纯化效果较好,纯化后的重组融合蛋白特异,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供了依据。