造纸工业是污染非常严重的行业之一，减少造纸行业污染的关键是木质素的有效降解。漆酶(lacease)、锰过氧化物酶(manganese peroxidase)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)是三种主要的木质素降解酶，它们组成的复合酶系是自然界中最高效的降解木质素的酶系。本研究对这三种酶的分子改造、酵母表达、分离纯化、酶学性质和对木质素的降解效果进行了系统的研究，为今后将其应用于造纸工业的制浆和漂白过程提供了理论和实践依据。 针对目前主要的几种基因合成方法具有步骤复杂、耗时、出错率高、费用昂贵等弊端，我们运用OE-PCR技术和DNA Works软件，通过采用40nt长的引物、分散基因中的AT碱基、提高退火温度、使用高保真的PrimerSTAR DNA聚合酶等措施，成功建立了一个基因合成与定点突变平台。该平台不但可以简单、快速、低成本地合成任何已知序列的基因，而且可以极大地减少基因合成中碱基的缺失和突变。此外，运用该平台还可以很容易地实现基因的定点突变。在本研究中，我们应用这个平台成功合成了具有酵母密码子偏好性的黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶和灰盖鬼伞菌过氧化物酶。在研究工作中，为了从没有蓝白反应的克隆中筛选到所需的转化子，我们在经典的碱裂解法基础上发展了一种用NaOH一步裂解法筛选重组子的快速鉴定方法，该方法快速而简单，可以高通量地从转化平板中筛选到所需的重组克隆，尤其适合筛选高拷贝、没有蓝白反应的重组克隆。上述两个技术平台的建立为本课题的顺利开展提供了技术保障。 野生的灰盖鬼伞菌过氧化物酶(Cip)酶活低，并且在高温、高pH情况下容易失活，这给它在造纸工业上的应用带来了限制。我们根据文献上的报道，利用上面建立的技术平台对野生型的Cip基因进行了一系列定点突变，并分别获得了具有4、6、7个氨基酸突变位点的Cip突变酶基因。我们将上述野生酶和突变酶基因分别连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，并转化毕赤酵母中进行分泌表达，获得了重组Cip酶和突变Cip酶。对这些酶酶学性质的研究表明，野生型酶在表达的第五天达到最大值，1.519955×105IU/L，最适反应pH2.2，最适反应温度45℃，pH＞3时酶活和酶稳定性迅速下降，30-80℃度都不稳定。突变酶的酶学特性都有都有不同程度改善，其中整体酶学特性最好的突变酶是cipmt7，它在第六天表达酶活最高，为2.74836×10SIU/L，最适反应pH为3.4，向中性pH值方向偏移2.2单位，pH2.2-5.6之间活性在60％以上，反应pH范围和野生相比向中性pH值方向偏移了2.6个单位，在pH5.6时野生型酶活性几乎为0，而cipmt7仍有61％的活性，在pH4.0时25℃保温7个小时，野生型的酶活只剩下30％，而cipmt7仍有60％活性，高温稳定性也有大幅度的提高。 锰过氧化物酶(Mnp)是木质素降解的关键酶之一，在纸浆生物漂白、有机污染物降解、染料脱色、褐煤生物降解等方面有着广泛应用。但是利用白腐真菌发酵获得Mnp，周期长，营养要求高，得率低不适合工业应用。我们利用上面建立的基因合成技术平台将Mnp基因进行了酵母密码子的最适化，然后重组到毕赤酵母中进行大量表达，并对重组酶的酶学特性进行了系统地研究。结果表明重组酶的酶活为诱导96小时活性最高，达2.565432×105IU/L，最适pH为3.6，pH＞4时酶活和pH稳定性迅速下降，最适反应温度为40℃，30-50℃比较稳定，50℃保温1小时活性剩余50％。 漆酶(Lac)也是一种重要的木质素降解酶。在造纸工业中应用漆酶的关键技术难点是如何获得大量的、廉价的漆酶资源及如何提高漆酶在工业环境下降解木质素的能力。利用毕赤酵母高效表达系统进行异源表达是提高漆酶产量的一条有效途径。但我们获得的天然云芝漆酶基因中含有过多的酶切位点，给重组表达载体的构建及线性化带来很大的不便。为此我们根据密码子的摆动性和酵母密码子的偏好性设计了引物对该基因进行改造，去掉基因内部的EcoRI，SacI位点，在5端加上EcoRI，3端加上XbaI位点。然后构建表达载体将将基因重组到毕赤酵母中大量表达，并对重组酶的酶学特性进行了系统地研究。结果表明在诱导的第6天酶活最高，达15000IU/L，最适pH为3.6，最适反应温度为35℃，35℃一小时内稳定。为了检测改造后的木质素降解复合酶系对木质素的降解效果，我们以一定的比例将三种酶混合后组成复合酶系，初步探索了木质素降解酶复合酶系对木质纤维材料中木质素的降解效果，结果表明复合酶比单一酶具有更好地木质素降解效果。至于复合酶系在造纸工业中制浆和漂白中的应用及效果，将是我们下一步工作的重点。