研究背景肾脏病是世界范围的公共卫生问题。终末期肾脏病发病率逐年升高。原发性肾小球肾炎是临床多发病，也是导致终末期肾病的主要原因。研究原发性肾小球肾炎的发病机制，在病变的早期阶段及时的干预，对于延缓病变、减少终末期肾脏病的发病，有重要意义。抗肾小球基底膜（glomerulus basement membrane，GBM）肾炎，又称Goodpasture病，是一种累及肾、肺的极为凶险的疾病。病起急促，预后差，死亡率高。临床表现为急进性肾炎综合症，肾功能进行性恶化。为揭示该病的发病机制并寻找较理想的治疗方式，医学界进行了大量研究。大鼠抗肾小球基底膜肾炎，也称肾毒血清性肾炎，是通过注射含有抗GBM抗体的血清导致大鼠肾功能恶化，出现新月体病理表现的动物模型。该病变为多种因素影响所致，体液免疫和细胞免疫共同起作用，确切机制不清。随着对抗肾小球基底膜肾炎发病机制的深入研究，医学界尝试将器官移植术后免疫调节药物应用于抗GBM肾炎的治疗并取得一定的疗效。雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）是从吸水性链霉菌发酵液中提取出来的一种低毒性大环内酯类抗生素，是安全有效低毒的新型免疫抑制剂。雷帕霉素受体为FK结合蛋白（FK binding proteins，FKBP-12）。雷帕霉素与相应的FKBP-12结合形成复合体，通过与哺乳动物雷帕霉素靶（Mamalian target of rapamycin，mTOR）结合导致mTOR失活，阻碍其下游信号转导通路：p70S6蛋白激酶被抑制，限制核糖体蛋白S6磷酸化及增殖细胞核抗原基因的转录；降低4E—BP1磷酸化，mRNA翻译起始过程受阻；抑制p27介导细胞周期依赖性激酶2循环素E的激活和DNA合成，阻止细胞由G1期至S期的进展，使细胞发育停滞在G1期。雷帕霉素强大的免疫调节功能使其获得了美国食品药品管理局批准，作为移植术后预防排斥一线药物应用于临床。体外实验证实雷帕霉素可以抑制生长因子介导的包括内皮细胞、肾小管细胞、成纤维细胞在内的多种细胞增殖。低剂量雷帕霉素即可抑制系膜细胞增殖。研究发现，雷帕霉素可抑制肾脏疾病进展中促炎症和促纤维化基因的表达。动物实验证实雷帕霉素能缓解膜性肾病中小管间质炎症细胞浸润和抑制纤维化进程。局灶节段性肾小球硬化病变早期给予雷帕霉素治疗能显著减弱肾小球硬化，缓解病情进展。雷帕霉素可抑制多囊肾大鼠的肾小管细胞增生，延缓肾功能衰竭进程。雷帕霉素可抑制肾切除后代偿性的肾肥大，可抑制UUO病变间质纤维化进程。雷帕霉素强大的抗炎、抗增殖、抗纤维化效应，将在防治肾病中发挥重要的作用。根据上述论据，我们推测雷帕霉素可能对抗GBM肾炎具有防治作用。如果这一假设得到证实，对于雷帕霉素临床防治抗GBM肾病将具有重要的理论指导意义。目的建立大鼠抗肾小球基底膜肾炎模型，为探讨该病的发病机制及干预治疗提供可靠稳定的模型制备方法。方法以大鼠肾皮质匀浆反复免疫新西兰白兔，制备兔抗鼠GBM肾毒血清。选择16只健康雄性SD大鼠，根据体重随机分为两组：模型组和对照组。每组8只大鼠。首先给予所有大鼠皮下注射兔lgG进行预免疫。5天后模型组大鼠经尾静脉一次性注射肾毒血清，对照组经尾静脉注射正常兔血清。建模第15天杀检，检测实验室指标变化情况及肾脏组织病理学改变情况。用免疫组化方法检测肾内ED-1+（单核巨噬细胞表面标志）细胞浸润。用ELISA法测定血清TGF-β1、MCP-1、VEGF含量；结果1．模型组大鼠产生大量的尿蛋白，第4天、7天、14天24h尿蛋白定量均显著高于对照组（P<0．01）。2．模型组大鼠血尿素氮、血总胆固醇升高，显著高于对照组（P<0．01）。模型组大鼠血肌酐升高，显著高于对照组（P<0．05）。模型组大鼠血白蛋白水平显著下降，低于对照组（P<0．01）。3．模型组大鼠肾脏重量增加，显著重于对照组（P<0．05）。4．免疫荧光检查显示，模型组大鼠肾小球内可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈连续线状沉积。对照组大鼠荧光抗体检测结果均为阴性。5．模型组大鼠出现新月体和蛋白管型等病理改变，与对照组具有显著性差异（P<0．01）。6．免疫组化染色显示，模型组大鼠肾小球中ED1+细胞浸润显著高于对照组（P<0．01）。7．ELISA测试显示，模型组大鼠血清TGF-β1、VEGF、MCP-1水平升高，显著高于对照组（P<0．05）。结论给大鼠注射兔抗鼠GBM肾毒血清，成功建立大鼠抗GBM肾炎模型。该模型病程进展快，疾病性状显著而且稳定，具有很高的科研应用价值。目的观察雷帕霉素对大鼠抗肾小球基底膜肾炎模型的干预作用并对机制进行初步探讨。方法根据第一部分的制备方法，建立大鼠抗GBM肾炎模型。选择健康雄性SD大鼠34只，根据体重随机将其分为五组，分组如下：M组（n=6），模型阳性对照组，建模后第15天杀检；R7组（n=7），建模后第7天起雷帕霉素(1mg·kg^-1·d^-1)灌胃给药，持续8天，建模后第15天杀检；R4组（n=7），建模后第4天起雷帕霉素(1mg·kg^-1·d^-1)灌胃给药，持续11天，建模后第15天杀检；R1组（n=7），建模后第1天起雷帕霉素(1mg·kg^-1·d^-1)进行灌胃，持续14天，建模后第15天杀检；N组（n=7），正常对照组。观察大鼠实验室指标变化情况及肾脏组织病理学改变情况。应用免疫组化方法观察大鼠ED-1、PCNA、α-SMA指标改变。应用实时定量PCR检测大鼠肾脏mRNA PCNA、MCP-1、TGF-β1表达变化。应用Western blot检测大鼠肾脏PCNA蛋白的变化。结果1．M组（模型对照组）大鼠产生大量的尿蛋白，第14天24h尿蛋白定量显著高于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，尿蛋白减少。R4组、R1组24h尿蛋白较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。2．M组（模型对照组）大鼠血肌酐升高，显著高于C组（正常对照组）（P<0．05）。雷帕霉素治疗后，血肌酐水平降低。R1组血肌酐较M组（模型对照组）显著下降（P<0．05）。3．M组（模型对照组）大鼠病理检查出现大量新月体和小管管型，与C组（正常对照组）差异显著（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，肾小管管型评分没有显著性差异，新月体减少。R4、R1组大鼠新月体较M组（模型对照组）显著减少（P<0．01）。4．免疫组化ED-1染色结果：M组（模型对照组）大鼠免疫组化染色ED-1+细胞增多，显著多于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，ED-1+细胞减少。R4、R1组ED-1+细胞较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。5．免疫组化PCNA染色结果：M组（模型对照组）大鼠免疫组化染色PCNA染色阳性细胞增加，显著多于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，PCNA染色阳性细胞减少。其中R4、R1组PCNA染色阳性细胞较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。6．免疫组化α-SMA染色半定量评分结果：M组（模型对照组）大鼠免疫组化α-SMA染色半定量评分上升，显著高于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，肾小球α—SMA半定量评分下降。其中R1组肾小球α—SMA半定量积分较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。7．实时定量PCR检测mRNA MCP-1表达：M组（模型对照组）大鼠肾mRNA MCP-1表达升高，显著高于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，肾mRNAMCP-1表达降低。其中R1、R4组mRNA MCP-1表达较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。8．实时定量PCR检测mRNA PCNA表达：M组（模型对照组）mRNA PCNA表达显著增加，显著高于C组（正常对照组）（P<0．05）。9．实时定量PCR检测mRNA TGF-β1表达：M组（模型对照组）大鼠肾mRNA TGF-β1表达升高，显著高于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，肾mRNATGF-β1表达降低。其中R1组mRNA TGF-β1表达较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。10．用Western Blot法检测肾PCNA蛋白水平结果表明：M组（模型对照组）大鼠肾PCNA蛋白表达升高，显著高于C组（正常对照组）（P<0．01）。雷帕霉素治疗后，PCNA蛋白表达降低。其中R4、R1组PCNA蛋白水平较M组（模型对照组）显著减少（P<0．05）。结论1．雷帕霉素能够降低抗GBM肾炎大鼠24h蛋白尿，改善肾功能，减少新月体产生。2．雷帕霉素能够缓解抗GBM肾炎的机制在于该药下调MCP-1、TGF-β1 mRNA表达，减少PCNA蛋白的表达，抑制单核巨噬细胞浸润缓解局部炎症反应，阻滞肾小囊上皮细胞转分化以缓解肾脏纤维化病程，抑制细胞增殖。