研究目的：　　单ADP核糖基转移酶（mono(ADP-ribosyl)transferase,ARTs）催化单ADP核糖基化反应（mono-ADP-ribosylation），对细胞多种蛋白质进行翻译后修饰，参与细胞间信号转导、细胞分化、增殖、蛋白分泌及运输等生理及病理过程。已有研究发现 ARTs可以参与调节淋巴细胞功能相关因子影响淋巴细胞功能，从而参与并促进炎症过程。在肿瘤性疾病中，有研究发现幽门螺旋杆菌可以调节ARTs的活性，继而调节胃癌细胞膜蛋白的构像，可能与胃癌发生发展有关系。还有研究也显示，肺癌A549细胞中及肝癌组织及HepG2细胞中均存在ART1的高表达，并提示与肿瘤的转移浸润相关；我们之前的研究也显示ART1对大肠癌细胞增殖、侵袭、迁移等具有调节作用。众所周知，肿瘤组织的血管生成与肿瘤的生长、浸润及预后有密切关系。但 ART1与肿瘤血管生成关系尚不清楚。本研究在先前研究基础上，以人大肠癌组织、人源性大肠癌LOVO细胞以及鼠源性大肠癌CT26细胞为研究对象，从肿瘤细胞及人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）两方面着手，探讨ART1对大肠癌血管生成的影响和可能的分子机制，为寻找抑制肿瘤转移和侵润新的可能靶点提供实验依据。　　研究方法：　　本研究共分三部分进行。　　1、ART1在人大肠癌组织及LOVO细胞中的表达及其与血管生成相关因子表达、肿瘤微血管密度（MVD）关系的研究　　(1) ART1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大肠癌组织中的表达及其与肿瘤微血管密度关系研究　　通过免疫组化及免疫荧光双标法检测人大肠癌组织中 ART1与VEGF、bFGF及整合素αVβ3等血管生成相关因子的表达与ART1/VEGF, ART1/bFGF, ART1/整合素αVβ3的共表达，评估其与肿瘤MVD的关系.　　(2) MIBG对人大肠癌 LOVO细胞 VEGF、bFGF及整合素αVβ3表达影响的研究　　通过免疫荧光及流式细胞术检测ART1特异性抑制剂MIBG应用后人大肠癌LOVO细胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3等血管生成相关因子表达变化及相互关系。　　2、ART1对血管内皮细胞增殖、迁移及微血管形成影响的离体及在体研究　　(1) ART1特异性抑制剂MIBG对VEGF及bFGF诱导的HUVECs增殖、迁移及血管形成能力影响的研究　　应用 CCK8、transwell侵袭实验及三维立体培养法观察 VEGF及bFGF诱导HUVECs增殖、迁移速度及血管形成情况，观察加入ART1特异竞争性抑制剂MIBG后，HUVECs增殖、迁移速度及血管形成的变化。　　(2) ART1基因沉默及高表达的大肠癌LOVO细胞VEGF及bFGF的表达及其对HUVECs增殖、迁移和血管形成能力影响的研究　　用携带 ART1-shRNA和 ART1-cDNA的慢病毒载体转染大肠癌LOVO细胞，建立大肠癌 LOVO细胞稳定的 ART1基因沉默（ART1-shRNA）及高表达（ART1-cDNA）转染株。以未转染的LOVO细胞（Untreated）及转染慢病毒空载体的LOVO细胞(LV-control)为对照组，免疫荧光和流式细胞术检测各组LOVO细胞VEGF及bFGF的表达；CCK8检测不同组别LOVO细胞培养上清液对HUVECs增殖的影响；用 transwell小室建立转染 LOVO细胞株与 HUVECs共培养系统，观察与不同组别LOVO细胞共培养的HUVECs迁移速度变化，并采用三维立体培养法观察其血管形成情况。　　（3）ART1对小鼠移植瘤微血管形成影响的在体研究　　应用携带ART1-shRNA或ART1-cDNA的慢病毒载体转染小鼠大肠癌CT26细胞株，并建立转染细胞小鼠脾脏移植瘤模型，采用免疫组化法检测不同组别移植瘤中 CD34的表达，计数不同转染组移植瘤组织中微血管密度（MVD），评估ART1与小鼠移植瘤肿瘤微血管形成的关系。　　3、ART1影响大肠癌微血管形成可能机制的初步研究　　从肿瘤细胞及HUVECs两个方面初步探讨ART1对肿瘤微血管形成相关信号通路的可能作用。　　（1） ART1对大肠癌LOVO细胞影响血管形成可能机制的初步研究　　以Untreated组及LV-control组为对照组，采用Western Blot检测携带ART1-shRNA和ART1-cDNA载体的各组LOVO细胞及各组CT26细胞小鼠移植瘤中Akt、p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF蛋白表达变化。　　（2）ART1对VEGF及bFGF诱导的HUVECs血管形成影响可能机制的初步研究　　检测 ART1特异竞争性抑制剂 MIBG对 HUVECs中 RhoA、ROCK1、P-ROCK1、FAK及P-FAK的表达的影响。　　研究结果：　　1、ART1在人大肠癌组织及LOVO细胞中的表达及其与血管生成相关因子表达、肿瘤微血管密度的关系　　（1）ART1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大肠癌组织中的表达及其与肿瘤微血管密度的关系　　与正常对照组比较，ART1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大肠癌组织中的表达明显增高，且ART1与VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表达呈正相关（ P<0.05）。ART1/VEGF,ART1/bFGF,ART1/整合素αVβ3共表达的人大肠癌微血管密度与非共表达组相比明显增高（P<0.05）。　　（2）MIBG对人大肠癌LOVO细胞VEGF、bFGF及整合素αVβ3表达的影响　　与常规培养的对照组LOVO细胞相比，加入ART1特异性抑制剂MIBG后，LOVO细胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3血管生成相关因子表达强度明显减弱，阳性表达细胞百分比减少（P<0.05）。　　2.离体和在体研究中，ART1对血管内皮细胞增殖、迁移及微血管形成的影响　　(1) ART1特异性抑制剂MIBG对VEGF及bFGF诱导的HUVECs增殖、迁移及血管形成能力的影响　　与常规培养的对照组相比，VEGF及bFGF诱导的HUVECs增殖、迁移速度和血管形成能力均明显增强（P<0.05），但加入ART1特异性抑制剂MIBG后，HUVECs增殖、迁移能力和血管形成能力则明显减弱（P<0.05）。　　(2) ART1基因沉默及高表达的大肠癌LOVO细胞VEGF及bFGF的表达及其对HUVECs增殖、迁移和血管形成能力的影响　　与Untreated组及LV-control组相比，ART1-shRNA组LOVO细胞VEGF及 bFGF免疫荧光表达明显减弱，阳性细胞百分比明显减少， ART1-cDNA组则相反（P<0.05）；加入ART1-shRNA组LOVO细胞上清液的HUVECs增殖活力明显减弱（P<0.05），而加入ART1-cDNA组LOVO细胞上清液的HUVECs增殖活力明显增强（P<0.05），且加入上清液越多，差别越大。　　在用transwell小室建立的LOVO细胞与HUVECs共培养系统中，与ART1-shRNA组LOVO细胞共培养的HUVECs迁移速度及体外微血管形成长度均明显低于Untreated组及LV-control组（P<0.05）；而与ART1-cDNA组LOVO细胞共培养的HUVECs迁移速度及体外微血管长度均明显高于Untreated组及LV-control组（P<0.05)。　　（3）在体研究中，ART1对小鼠移植瘤微血管形成的影响　　在小鼠脾脏移植瘤模型中，ART1-shRNA组形成的移植瘤微血管密度明显低于Untreated组及LV-control组（P<0.05），ART1-cDNA组移植瘤微血管密度明显高于Untreated组及LV-control组（P<0.05）。　　3、ART1影响大肠癌微血管形成可能机制的初步研究　　（1）ART1对与各族大肠癌LOVO细胞共培养的HUVECs血管形成影响可能机制的初步研究　　与Untreated组及LV-control组比较，ART1-cDNA组LOVO细胞p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF的表达明显增强（P<0.05），ART1-shRNA组LOVO细胞各蛋白的表达则明显减弱（P<0.05）；在对小鼠CT26移植瘤的蛋白检测中也观察到，ART1-cDNA组 CT26细胞 p-Akt， HIF-1a，VEGF, bFGF的表达增强（P<0.05）,ART1-shRNA组则减弱（P<0.05），t-Akt的表达与Untreated组及LV-control组相比未见明显差别(P>0.05)。　　（2）ART1对VEGF及bFGF诱导的HUVECs血管形成影响可能机制的初步研究　　与常规培养的对照组相比，VEGF及 bFGF诱导的 HUVECs中RhoA、P- ROCK1及 P-FAK的表达明显增强（P<0.05），而当加入ART1特异性抑制剂MIBG后，HUVECs中RhoA、P-ROCK1及P-FAK的表达明显减弱（P<0.05）；而t-ROCK1及t-FAK的表达与对照组相比未见明显差别(P>0.05)。　　结论：　　1、在大肠癌组织和细胞中存在ART1的高表达，且与血管生成相关因子VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表达呈正相关;ART1/VEGF, ART1/bFGF, ART1/整合素αVβ3共表达与肿瘤微血管密度呈正相关；ART1特异竞争性抑制剂MIBG可以明显抑制LOVO细胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表达，提示ART1可能促进肿瘤细胞VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表达，并与肿瘤微血管形成有关。　　2. ART1特异竞争性抑制剂MIBG可明显抑制由VEGF及bFGF诱导的HUVECs的增殖、迁移及血管形成能力，且ART1-cDNA组LOVO细胞VEGF和bFGF表达阳性细胞百分比均增加，其细胞培养上清液可以明显促进HUVECs增殖，与之共培养的HUVECs迁移能力及血管形成能力均明显增强，ART1-shRNA组结果相反。ART1-cDNA组的CT26细胞形成的小鼠移植瘤MVD明显增高，ART1-shRNA组则相反。以上结果提示ART1可促进VEGF及bFGF的释放，并可能通过参与HUVECs增殖、运动及血管形成能力的调节，促进肿瘤血管形成。　　3.在LOVO细胞中，ART1-cDNA组细胞p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF的表达明显增强，ART1基因沉默组结果相反。提示ART1可能通过促进Akt的磷酸化，上调HIF-1a的表达，在肿瘤细胞中增加VEGF、bFGF的表达与分泌，进而促进肿瘤微血管的生成。　　在VEGF/bFGF诱导的HUVECs中，ART1特异性抑制剂MIBG明显抑制HUVECs中RhoA、P-ROCK1及P-FAK的表达，提示ART1在HUVECs中RhoA/ROCK1/FAK信号通路的调节具有作用，其可能通过上调的RhoA的表达，促进ROCK1和FAK的磷酸化，从而增强HUVECs的增殖和迁移运动能力，促进血管形成。　　4、ART1有望成为抑制肿瘤血管生成的新靶点。