论文部分内容阅读
目的结膜是眼表组织的重要组成部分，对维持眼表的完整和泪膜的稳定至关重要。当因外伤或自身疾病导致结膜细胞丢失和功能丧失时可使泪液膜的完整性破坏进而引起瘢痕形成、睑球粘连和眼球运动受限。这是一类难治性的严重致盲性眼表疾病。目前常规的治疗方法是用正常的结膜或结膜替代物行结膜重建。目前应用于临床的结膜重建包括自体结膜移植、唇粘膜移植、异体结膜移植、羊膜移植等，但各种方法都有不同的缺点。最理想的方法是利用组织工程方法，选择适当的种子细胞，培养构建具有正常生理功能的结膜组织片。人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)是骨髓中与造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)不同的，具有向骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织等多种组织细胞分化的成体干细胞。hMSCs在体外可以大量增殖，并具有克隆形成的能力。由于其具有多向分化的潜能，在体外又较容易培养扩增，加之具有潜在的细胞治疗价值，故成为生物学界和医学界的研究热点。本研究分离培养和鉴定人的结膜上皮细胞、hMSCs，利用不同的诱导条件对hMSCs进行诱导分化，为临床治疗结膜疾病提供一个新思路。方法一、正常人结膜细胞的培养与鉴定1、材料和方法结膜取自中国医科大学附属一院眼科角膜取材后的供体眼球。供体均为身体健康，无眼病史的正常人。平均年龄34.5岁。死后4h内取材。采用消化后组织块法培养结膜原代细胞，并进行传代。2、培养结膜细胞的免疫组化鉴定把第2代的结膜细胞接种于置在培养皿中的盖玻片上，当细胞接近融合时，及时取出作原位甲醇固定，CK13单抗、DAB显色免疫组化染色。3、结膜细胞生长曲线的测定随机选取第1、3、5传代细胞，以5×10~4／ml密度传代、分别培养1-9天，每天分别细胞计数并进行分析比较，重复3次。结果以均数土标准差((?)+s)表示。4、培养结膜细胞的RT-PCR检测总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)提取培养结膜上皮细胞总RNA，-70℃保存备用。按照NCBI公布的Muc4、Muc5ac基因序列，设计引物。分别加入不同引物，PCR终体系25μl。取PCR产物10μl经2％的琼脂糖凝胶电泳。二、人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定1、材料和方法骨髓来源：来自临床检查骨髓的正常结果者，平均年龄40.6岁。采用全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞，并进行传代观察。2、培养骨髓间充质干细胞的免疫组化鉴定把第3代的骨髓间充质干细胞接种于置在培养皿中的盖玻片上，当细胞接近融合时，用CD44单抗、DAB显色免疫组化染色。3、培养骨髓间充质干细胞生长曲线的测定随机选取第1、4、8传代细胞，以1×10~4／ml密度传代，分别培养1-9天，每天分别细胞计数并进行分析比较，实验重复3次。结果以均数±标准差((?)±s)表示。4、流式细胞仪检测取扩增传代的1，3，5代细胞。CD34-PE，CD45-FITC，CD44-FITC，CD29-PE单克隆抗体，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪分析5000个细胞，检测阳性率。重复3次，结果用均数士标准差((?)±s)表示。三、骨髓间充质干细胞向结膜样细胞诱导分化的研究1、人结膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞的共同培养将传代后的P2-P4代骨髓间充质干细胞按4～5×10~4／ml的细胞密度接种于六孔Transwell培养板底层(预置盖玻片)，将传代后的P2-P3代结膜上皮细胞按6×10~4／ml接种于Transwell培养板上层，共同培养11天。2、共同培养骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定共同培养11天后，底层培养细胞达到70-80％左右融合时，取出Transwell培养板底层的盖玻片，CK13单抗、DAB显色免疫组化染色。3、共同培养骨髓间充质干细胞RT-PCR检测提取共同培养11天骨髓间充质干细胞总RNA，-70℃保存备用。按照NCBI公布的Muc4、Muc5ac基因序列，设计引物。分别加入不同引物，PCR终体系25μl。取PCR产物10μl经2％的琼脂糖凝胶电泳。结果一、正常人结膜细胞的培养与鉴定1、活体细胞的形态消化后组织块培养法：48小时后见大量上皮细胞贴壁，细胞不规则呈圆形、椭圆形、多边形，细胞体肥大透亮，细胞核位于中央，胞膜清楚，约12-14天后细胞呈镶嵌状排列，融合成膜状。2、免疫组化鉴定培养的人结膜上皮细胞CK13免疫组化染色见阳性颗粒均匀分布于胞浆中。3、培养结膜细胞生长曲线传代培养多数样本于P5代以后开始出现衰老征象。传代细胞的生长较原代要慢些，传代培养潜伏期约为48～60h；传代培养对数增殖期约为3～7d；对数增殖期结束后，结膜细胞生长逐渐缓慢，进入平台期。4、RT-PCR检测人结膜细胞Muc4 mRNA、Muc5ac mRNA在培养的正常人结膜细胞中均有表达。二、人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定1、活体细胞的形态原代细胞培养72小时后，细胞贴壁，呈纺锤型、梭型、多角形，增值迅速，10天细胞呈长梭形，克隆样生长，达80-90％融合。传代培养细胞形态与原代细胞基本一致，增殖迅速，约7-9天达到80-90％融合。2、培养骨髓间充质干细胞的免疫组化鉴定免疫组化CD44染色，骨髓间充质干细胞胞浆阳性染色。3、培养骨髓间充质干细胞生长曲线的测定传代培养多数样本于P8代以后开始出现衰老征象。传代细胞的生长较原代要慢些，多于接种后9天左右即可铺满整个培养孔的底面。传代培养潜伏期约为24～36h；传代培养对数增殖期约为4～6d；对数增殖期结束后，细胞生长逐渐缓慢，进入平台期。4、流式细胞仪检测流式细胞检测结果表明，所培养的骨髓间充质干细胞表面有粘附分子的表达，CD29，CD44阳性标记出现单峰，造血细胞分化抗原CD34，CD45表达阴性，经扩增传代后的各代骨髓骨髓间充质干细胞表面标记表达阳性率无明显差异(P＞0.05)。三、骨髓间充质干细胞向结膜样细胞诱导分化的研究1、人结膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞的共同培养共同培养72小时后，贴壁骨髓间充质干细胞部分呈椭圆形、圆形改变，部分呈梭形。共同培养11天后，大部分细胞呈多边形、圆形、椭圆形，少量细胞呈梭形。2、共同培养骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定共同培养11天后，CK13单抗，DAB显色免疫组化染色，骨髓间充质干细胞分化细胞CK13免疫组化染色阳性。3、共同培养骨髓间充质干细胞RT-PCR检测骨髓间充质干细胞分化细胞Muc4MRNA表达阳性，Muc5acMRNA表达阴性。结论1、消化后组织块培养法可以获得正常结膜上皮细胞，2-3代结膜上皮细胞适合其他研究。2、全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞可以获得高纯度的具有正常功能的间充质干细胞，用于诱导分化研究不宜超过4-5代。3、骨髓间充质干细胞可以诱导分化成结膜样上皮细胞。4、分化细胞具有部分正常结膜上皮细胞功能。