论文部分内容阅读
第一部分降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3.1／CGRP的构建目的构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因（rCGRP）的重组真核表达载体pcDNA3.1（+）／rCGRP，用于基因治疗糖尿病性勃起功能障碍的实验研究。方法根据Genbank中rCGRP基因序列设计一对DNA引物，在引物上加上双酶切位点，Trizol试剂从大鼠脑组织提取总RNA，RT-PCR扩增rCGRPcDNA，产物通过HindⅢ和BamHⅠ酶切、QIAquick Gel Extraction Kit纯化、16℃过夜连接，将目的基因插入真核表达质粒载体pcDNA3.1（+），转化E．Coli．DH5α感受态细菌，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆，确证pcDNA3.1（+）／rCGRP构建成功后再用QIAGEN Plasmid Midi Kit大量扩增、纯化质粒备用。结果（1）总RNA质量分析所抽提得总RNAOD260／OD280=1.8497＞1.8，1.5％琼脂糖凝胶电泳可见28S和18S两条清晰条带；（2）RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合。（3）重组克隆鉴定①PCR鉴定PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合；②酶切鉴定抽提质粒经双酶切，酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带，分别和pcDNA3.1（+）和rCGRPcDNA大小相吻合；③DNA测序测序结果经BLAST分析，与rCGRP基因编码区全长序列完全一致。结论（1）大鼠脑组织中有rCGRP的表达；（2）通过RT-PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3.1（+）／rCGRP。第二部分糖尿病大鼠模型的建立及勃起功能测定目的建立勃起功能显著低于正常水平的糖尿病（DM）大鼠模型，为进一步行糖尿病性勃起功能障碍（DMED）的CGRP转基因治疗提供理想的动物模型。方法150只10周龄SD雄性大鼠，体重200-250g，随机分成对照组（n=12）和实验组（n=138）。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液60 mg／kg，对照组腹腔注射相应剂量的0.1M pH4.5枸椽酸钠溶液。注射后3d，于尾静脉采血测血糖，后每2wk测血糖1次。实验期间按照DM判断标准判断每只大鼠DM模型成功与否。STZ注射后10wk，从DM模型制作成功的大鼠中随机选取12只，测定阴茎组织的rCGRPmRNA、CGRP表达及阴茎的基础阴茎内压（ICP）和神经刺激诱导ICP，并和正常对照组比较。结果（1）一般情况STZ注射后第5、7、8wk各有1只大鼠死亡。4只大鼠于第8、10wk血糖未达糖尿病标准，糖尿病表现不明显，判为STZ抵抗。138只大鼠中DM模型制作成功131只定为DM组，成功率94.9％。（2）血糖、体重DM组STZ注射后各时间点的血糖水平均显著高于对照组（P＜0.001）；STZ注射前DM组和对照组的体重无显著性差异（P＞0.05），而注射后10wk DM组的体重显著低于对照组（P＜0.001），平均体重较对照组低30.4％。（3）rCGRPmRNA和CGRP蛋白的表达STZ注射后10wk，DM组rCGRPmRNA和CGRP的相对量分别为0.49±0.23和0.030±0.011，分别显著低于对照组的0.88±0.27和0.064±0.022（P＜0.001）。（4）两组大鼠间ICP比较STZ注射后10wk，DM组的基础ICP和神经刺激诱导ICP分别为8.7±3.4和54.6±17.5cmH2O，分别显著低于对照组的36.8±11.2和156.3±38.4 cmH2O（P＜0.001），DM组的基础ICP和神经刺激诱导ICP较对照组分别低76.4％和65.1％。结论以STZ60mg／kg腹腔注射建立DM大鼠模型操作方便、成功率高，而且所制作的DM大鼠模型阴茎的基础ICP和神经刺激诱导ICP均显著低于正常大鼠，能成为理想的DMED研究的动物模型。第三部分CGRP基因导入阴茎海绵体后的表达及对糖尿病大鼠勃起功能的影响目的通过重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）／rCGRP，将rCGRP基因导入DM大鼠阴茎海绵体组织，研究rCGRP基因导入后不同时间点在阴茎组织中的表达及对勃起功能的作用。方法SD雄性DM大鼠119只随机分成3组：pcDNA3.1／rCGRP处理组（A组）、pcDNA3.1空质粒对照组（B组）、PBS空白对照组（C组）。A组每只大鼠阴茎海绵体注射含pcDNA3.1（+）／rCGRP200μg的20％蔗糖PBS液，B、C组分别注射相当量的pcDNA3.1空质粒和20％蔗糖PBS。分别于注射后1、3、7和14d，每组随机选取9-10只大鼠在麻醉下进行基础和神经刺激诱导ICP测定，然后处死大鼠，从根部切除完整的阴茎组织，分别用RT-PCR和Western Blot法半定量阴茎组织中CGRPmRNA和CGRP含量。结果（1）CGRPmRNA表达水平注射后1d、3d、7d、14d，A组CGRPmRNA相对量均显著高于B、C组（P＜0.01．0.001），而B、C组间均无显著性差异（P＞0.05）；A、B、C组内1d、3d、7d、14d CGRPmRNA的相对量间均无显著性差异（P＞0.05）。（2）CGRP表达水平注射后1d、3d、7d、14d，A组CGRP表达相对量均显著高于B、C组（P＜0.01，0.001），而B、C组间均无显著性差异（P＞0.05）；A、B、C组内1d、3d、7d、14d CGRP表达相对量间均无显著性差异（P＞0.05）。（3）ICP水平①基础ICP：注射后1d、3d、7d、14d，A、B、C组间比较均无显著性差异（P＞0.05）；三组内不同时间点之间比较，注射后1d的基础ICP均显著高于3d、7d、14d的基础ICP（P＜0.05）；②神经刺激诱导ICP注射后3d、7d、14d，A组神经刺激诱导ICP均显著高于B、C组（P＜0.001），而注射后1d三组间无显著性差异（P＞0.05）；注射后1d、3d、7d、14d，B、C组间的神经刺激诱导ICP均无显著性差异（P＞0.05）；三组内不同时间点之间比较，A组注射后1d的神经刺激诱导ICP显著低于注射后3d、7d、14d（P＜0.01，0.001），而3d、7d、14d间却无显著性差异（P＞0.05）；B、C组内1d、3d、7d、14d神经刺激诱导ICP间均无显著性差异（P＞0.05）。结论成功将重组质粒pcDNA3.1（+）／rCGRP转染DM大鼠阴茎海绵体，并持续、稳定表达至少2wk，同时使DM大鼠的勃起功能得到明显改善。