目的:纤维素是地球上数量最多的可再生资源。它具有稳定的化学结构,不易被降解。随着粮食短缺,能源危机和环境污染的日益严重,如何合理的利用现存的大量的纤维素供能,成为人们关注的问题。　　 纤维素酶是一种催化纤维素分解的酶。用纤维素酶分解纤维素具有高效、方便、副产品少等优势,成为研究的热点。研究发现很多生物都产生纤维素酶,如细菌、放线菌、真菌、昆虫等。其中真菌因产生的纤维素酶种类多,活力高而受到人们的关注。维素酶分为三种类型:内切葡萄糖苷酶(EG),纤维二糖水解酶(CBH),β-葡萄糖苷酶(BG)。　　 国内纤维素酶的产量较低,大部分需要进口。人们利用多种方法来提高纤维素酶的产量和活力。传统的菌种选育和几种酶的混合搭配,对酶的催化作用提高不大。将基因工程的方法应用于酶学领域,对纤维素酶的研究向前推进一步。例如:人们用活性位点突变的方法,改变酶蛋白的折叠,来提高酶的活性。人们也将纤维素酶的基因转入到工程菌中进行表达,以提高它的产量。目前使用的工程菌有很多,如大肠杆菌、酿酒酵母菌、毕赤酵母菌等等。其中,毕赤酵母菌表达真核蛋白具有产量高、易培养、对蛋白的修饰与真核生物相似等独特的优点而被广泛的应用。　　 中科院微生物所在1970年从腐殖土里分离得到了一株特异腐质霉H31-3。该菌产生的中性纤维素酶耐高温,且有较广的PH值稳定性,非常适用于工业生产。石家骥老师等,对该菌进行了突变,使它的产酶量和活力进一步提高。该实验室将突变后特异腐质霉产生的三种主要的纤维素酶进行了纯化和质谱分析。质谱结果显示,突变后的特异腐质霉分泌cbh2蛋白与灰色腐质酶热变种产生的纤维二糖水解酶O93780具有相同的氨基酸序列。由于,真菌产生的纤维素酶基因的同源性较高,在纤维素酶催化区和纤维素结合区的核苷酸序列保守性很强。不能仅由质谱结果确定这两个蛋白相同。另外,具有相同氨基酸的蛋白,如果来自于不同的菌株,可能会有不同的基因型.因此,为了对cbh2进行开发,首先要确定突变后特意腐质霉cbh2的基因,再将cbh2表达,获得大量的分泌型cbh2蛋白。本实验的目的是确定特异腐质酶H31-3 cbh2的基因,再将其转入毕赤酵母菌中进行表达和分泌。　　 方法:　　 1.确定特突变后异腐质霉的H31-3cbh2基因序列　　 1.1部分cbb.2基因片段的克隆　　 先提突变后的特意腐质霉基因组DNA,依据cbh2的质谱结果中与O93780相似的氨基酸序列设计引物P1和P2。扩增出长约500bp的基因片段。胶回收、测序,用BLAST软件与报道的O93780基因比对。测序结果与O93780的部分基因片段相同。　　 1.2 cbh2基因全长的克隆并与O93780基因进行比对　　 依据报道的O93780全基因序列设计引物P3和P4,扩增出长约1500bp的基因片段。胶回收,连接到pEASY-T载体上,将该重组产物转入大肠感受态中扩增。用含有青霉素的LB平板筛选阳性转化子,将长出的转化子小量培养,提质粒,用P3和P4引物进行PCR验证,将验证为阳性的质粒测序。测序结果与O93780的全基因序列比对。比对结果显示,测序结果与O93780全的基因序列完全相符。　　 2.构建两种分泌型的表达载体,一是带有载体自身信号肽的pGAPZαA-cbh2 cDNA,一是带有cbh2蛋白自身信号肽的pGAPZA-cbh2 cDNA2　　 2.1特异腐质霉总RNA的提取　　 2.2无蛋白自身信号肽的cbb2 cDNA和带自身信号肽的cbh2 cDNA2的克隆　　 依据NCBI报道的O93780去信号肽的基因序列,设计引物P5和P6,其中P5去掉O93780前面的24个氨基酸信号肽,并加上EcoR1酶切位点及保护性碱基。P6加上Not1酶切位点和保护性碱基。用RT-PCR的方法得到了去掉信号肽的cbh2 cDNA。带有信号肽的cbh2 cDNA2用P7和P6为引物,用RT-PCR的方法合成。　　 2.3将重组载体pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbb.2 cDNA2转入大肠感受态中进行扩增　　 将上述RT-PCR产物胶回收与pEASY-T连接,形成重组质粒pEASY-T-cbh2 cDNA和pEASY-T-cbh2 cDNA2,将上述两种重组质粒用化学方法转入大肠杆菌中。用含有青霉素的LB培养基筛选阳性转化子,将长出的转化子进行小量培养,分别用两对引物P7、P6和P5、P6,进行PCR,鉴定cbh2 cDNA和cbh2 cDNA2,将鉴定为阳性的质粒测序。测序结果与O93780的基因序列比对,确定两种cbh2 cDNA的扩增的正确性。　　 2.4构建两种分泌型的重组质粒并转入大肠感受态中扩增　　 分别将测序正确的cbh2 cDNA、cbh2 cDNA2与pGAPZaA和pGAPZA载体用EcoR1和Not1双酶切,连接,以化学转化的方法将该重组质粒转入大肠感受态中扩增。用带有Zeocin抗性的LB平板筛菌。将长出的转化子进行小量培养,提质粒,用两对引物(P5和P6;P7和P6)进行PCR验证,将验证为阳性的质粒送去测序,测序引物为a-factor和3-AOX。将　　 2个测序结果与O93780 cDNA核苷酸序列比对,确定cbh2 cDNA和cbh2cDNA2在表达载体pGAPZA和pGAPZaA中的插入是否正确。　　 3将重组正确的pGAPZaA-cbh2 cDNA与pGAPZA-cbh2 cDNA2转入毕赤酵母菌中进行分泌　　 3.1制备毕赤酵母感受态细胞　　 3.2将重组质粒pGAPZaA-cbh2 cDNA与pGAPZA-cbh2 cDNA2用BspH1线性化　　 3.3将上述线性化产物以电转化的方法转入毕赤酵母感受态细胞中,用含有Zeocin抗性的YPD平板进行筛选。将转化子用YPD培养基进行培养,提毕赤酵母的基因组DNA,用两对P5和P6;P7和P6,以PCR的方法来验证cbh2 cDNA及cbh2 cDNA2是否整合到毕赤酵母基因组染色体上。并以a-factor和3-AOX为引物测序验证整合是否正确。　　 3.4验证cbh2蛋白分泌　　 将整合有外源基因的毕赤酵母在YPD培养基中培养48小时,收集上清粗酶液,用SDS-PAGE方法确定粗酶液中是否有特异的蛋白条带产生,观察特异性条带的大小,并将特异性条带切下来,做质谱分析。　　 3.5测定毕赤酵母中分泌的上述cbh2蛋白的最适温度,最适PH和温度稳定性　　 4.用甲醇诱导毕赤酵母菌cbh2的表达　　 将整合有pGAPZaA-cbh2 cDNA的毕赤酵母菌接种于BMGY培养基中生长至菌密度OD600=3,收集菌体转接于BMMY培养集中,用1％甲醇诱导表达,测定分泌蛋白的活性。　　 结果:　　 1突变特异腐质霉cbh2与灰色腐质霉热变种O93780有相同的核苷酸序列,这两种蛋白具有相同的基因。　　 2成功在毕赤酵母菌中表达了特变特意腐质霉分子量为55KD的H31-3cbh2　　 3蛋白自身的信号肽不能将cbh2分泌到胞外,载体的信号肽可以将cbh2蛋白分泌到胞外。在BMMY培养基中,用1％的甲醇诱导cbh2蛋白表达失败。　　 4毕赤酵母菌分泌的cbh2蛋白其最适PH值为8,最适温度为70℃。在50℃保存12小时后,酶活依旧有65％。　　 结论:　　 1突变特异腐质霉(H31-3)cbh2与灰色腐质霉热变种O93780有相同基因。　　 2在毕赤酵母菌中表达了最适PH为8,最适温度为70℃,分子量为55KD的可分泌的突变特异腐质霉H31-3 cbh2