研究背景：心力衰竭(心衰)是缺血性心脏病、高血压病、瓣膜性心脏病等多种心血管疾病的共同终末阶段。在中国，成年人心衰的患病率约为0.9％，随着人口老龄化社会的发展，人群中心衰患者人数将不断上升。目前针对心衰发病机制的多种治疗手段虽能改善其症状，但心衰患者的5年生存率仍然低于50％，提示在心衰的发生发展过程中可能还有其他未知因素的参与。心衰的病理生理机制极其复杂，多种因素参与其发生发展。近年来发现，在部分心衰患者血清中存在有抗G-蛋白偶联受体家族中几种主要受体(如肾上腺素β1受体、α1受体、胆碱能M2受体、血管紧张素Ⅱ1型受体)的自身抗体。进一步的研究提示，这些自身抗体在心衰的发生发展中具有一定的病理生理意义。
　　 目的：⑴观察β3AA能否减轻大鼠心衰的程度；⑵观察β3AA是否能降低心衰大鼠对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性。
　　 方法①选用8周龄、重量为140-160g、健康雄性Wistar大鼠20只，随机分为对照组与免疫组。以合成的β3AR细胞外第二环氨基酸肽段为抗原(176aa～200aa，R V G A D A E A Q EC H S N P R C C S F A S N M P，中国医学科学院上海生物化学院)进行免疫，每隔两周免疫一次，共免疫8周。对照组只注射相应佐剂，方法同免疫组。采用本实验室改良的ELISA方法检测免疫鼠血清中β3AA的水平。利用IgG亲和纯化试剂盒(Mab.Trap Kit)纯化β3AA阳性的免疫大鼠血清中的IgG。将纯化后的IgG进行定量、定性，并常规SDS-PAGE凝胶电泳法检测其纯度。②选用10周龄、重量为200-220g、健康雄性Wistar大鼠。用10％水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，在剑突下1 cm沿正中线作一切口，分离腹主动脉，将7号针头与腹主动脉一并结扎，然后抽出探针形成腹主动脉狭窄(约50％)，同时腹腔一次性注射庆大霉素抗感染，分层缝合关腹。③将提纯的β3AA阳性的IgG，以2μg/g的剂量，通过尾静脉给入腹主动脉缩窄手术后3天的大鼠体内，每10天加强免疫一次，共免疫50天；免疫前1天，经鼠尾取血样，分离血清，用SA-ELISA法检测其中β3AA的水平。对照组以2μg/g的剂量通过尾静脉给入β3AA阴性的IgG，免疫程序和检测方法同上。④应用生物信号记录分析系统MS2000记录各心功能参数，包括左心室收缩压(LVSP)，左心室舒张末压(LVEDP)以及左心室内压上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)。⑤开胸，迅速取出心脏，洗净心腔内积血，去除心脏周围组织及血管，用滤纸吸干水分后，称量全心重，计算心脏重量与体重的比值。⑥血清中BNP的测定采用ELISA试剂盒(ADL，美国)进行测定，具体操作按照说明书进行。⑦取进行腹主动脉缩窄术制备的心衰大鼠，用氨基甲酸乙酯(20％，1g/kg，i.p.)腹腔注射麻醉后，左冠脉前降支结扎30 min后，松开结扎线再灌注3 h；假手术组大鼠手术操作相同，将缝合针穿过左冠脉前降支下方，但不结扎。⑧应用TTC染色法，测定β3AA输入的心衰大鼠经历心肌缺血/再灌注手术后心肌梗死面积。⑨应用Caspase3测定试剂盒，检测大鼠心肌组织中caspase3的活性。⑩利用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)，检测大鼠心肌组织中细胞凋亡数量，并计算心肌细胞凋亡指数。
　　 结果：⑴腹主动脉缩窄术后8周，大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明显下降，LVEDP明显升高，心功能开始下降；腹主动脉缩窄术后12周、16周，大鼠心功能进行性恶化。⑵腹主动脉缩窄术后8周，大鼠血清中β3AA明显升高(0.31±0.02 vs.0.22±0.05，P＜0.05)，术后12周达到高峰，之后开始下降。以上结果提示，腹主动脉缩窄术后0～8周是大鼠心功能从正常到明显下降的过程，是大鼠心衰发生发展非常重要的时期；而且此期间，是β3AA产生的过程，体外给予β3AA可以单纯研究其对大鼠心脏的保护作用。因此本研究选择在腹主动脉缩窄术后0～8周，研究在大鼠心衰发生发展过程中，β3AA对心脏功能的影响。⑶腹主动脉缩窄术后8周，大鼠LVSP和+dp/dtmax明显下降，LVEDP和-dp/dtmax显著升高。说明，腹主动脉缩窄术后8周，大鼠心衰模型制备成功。⑷与伪手术组相比，腹主动脉缩窄术后8周大鼠心重/体重比明显增大。提示，心衰大鼠心脏发生了心肌重构。以上结果提示，腹主动脉缩窄术后8周，大鼠心脏已经发生明显的心肌重构，而且心功能已经表现出失代偿现象。⑸分别以0.5μg/g、1μg/g、2μg/g的剂量，将β3AA输入腹主动脉缩窄术后的大鼠，免疫后第1天，采血检测大鼠血清中β3AA的水平。以2μg/g输入后，大鼠血清中β3AA的平均OD值为0.67，与临床相匹配，故作为最终免疫剂量。⑹应用ELISA法对β3AA的IgG亚类鉴定结果表明，免疫鼠中的β3AA主要属于IgG2b，还有极少部分属于IgG2a。有研究表明不同的IgG亚类具有不同的代谢半衰期，IgG2b亚类的代谢半衰期为6天左右，IgG2a亚类的代谢半衰期为8天左右。明确β3AA的主要IgG亚类则可以为输入周期的选择提供一定的理论依据。⑺β3AA输入腹主动脉缩窄术后大鼠第1天，大鼠血清中抗体水平增高，平均OD值为0.67，与对照组相比增高了0.35。抗体水平下降其增高值的一半所需的时间大约为10天。因此本研究将免疫周期确定为10天。⑻以2μg/g为免疫剂量，10天为免疫周期，β3AA输入腹主动脉缩窄术后大鼠，定期监测大鼠血清中β3AA水平，发现该抗体水平能够稳定维持(图11)。提示β3AA输入心衰大鼠模型制备成功。⑼血清BNP水平与心力衰竭的临床严重程度相平行。实时监测心衰大鼠血清中BNP的水平，腹主动脉缩窄术后2周的心衰大鼠，血清中BNP开始有轻度升高；术后6周，β3AA输入心衰大鼠组血清中BNP水平升高程度低于未进行β3AA输入的心衰大鼠组；术后8周，β3AA输入心衰大鼠组血清中BNP的水平较β3AA未免疫心衰大鼠组明显降低。提示，β3AA输入组大鼠心衰程度相对较轻。⑽腹主动脉缩窄术后8周，β3AA输入组的+dp/dtmax及-dp/dtmax降低幅度均低于未免疫组。⑾β3AA输入心衰大鼠组经历心肌缺血/再灌注手术后，发现β3AA的输入可以明显延长大鼠心肌缺血/再灌注手术后的生存时间。⑿β3AA输入心衰大鼠组，经历心肌缺血/再灌注手术后，心梗面积较对照组明显减小。⒀β3AA输入心衰大鼠组，经历心肌缺血/再灌注手术后，TUNEL染色阳性细胞明显减少，心肌组织caspase-3活性明显降低。
　　 结论：①β3AA输入压力后负荷性心衰大鼠后，可以使其心功能恶化程度明显减轻、血清中BNP释放减少；②当心衰大鼠经历心肌缺血/再灌注损伤时，β3AA可以改善其生存情况，并可以减少心肌缺血/再灌注引起的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。