论文部分内容阅读
20世纪以来,随着排放到空气中的氯氟烃及其他氮氧化物（如N2O等）的增加,导致了地球表面臭氧层不断变薄以至出现臭氧空洞,到达地面的太阳光中的UV-B（ultraviolet-B）辐射也随之增强。UV-B辐射增强对植物的生长和代谢等产生了多方面影响,在此过程中,UV-B辐射不仅是一种环境胁迫因子,而且还是信号调节的重要成员。微管正末端结合蛋白1（End Binding Protein 1,EB1）,相对分子质量约32KD,是一种进化上保守的微管正末端结合蛋白,定位在正在生长微管的正末端,可以调节微管动态性并招募细胞内其他与之相互作用的微管正末端追踪蛋白（MAPs）方面都具有重要作用。拟南芥EB1家族成员有EB1a、EB1b和EB1c,EB1a和EB1b能够相互作用形成异二聚体,而EB1c不参与。在EB1c的C端有一个核定位信号NLS,对有丝分裂纺锤体定位和染色体的分离有重要的调控作用。为了研究在UV-B辐射增强条件下,拟南芥中EB1c的响应机制,我们拟以拟南芥野生型（WT）植株、突变体（eb1c）植株和转基因（EB1c:GFP）植株为材料。对eb1c突变体,在DNA水平上通过“三引物法”进行初步鉴定,之后在RNA水平上以actin作为内参进一步进行验证,最终得到eb1c突变体的纯合株系;与野生型作表型对比,发现一周龄的突变体植株根长比野生型短且差异不显著,抽薹提前,到后期两种植株的在果荚长度、株高方面没有显著性差异。以本实验室前期构建成功的pSuper1300-EB1c-GFP重组质粒为材料,重新进行测序验证重组质粒;将构建成功的重组质粒在拟南芥原生质体和烟草表皮细胞中进行瞬时表达,结果在两种瞬时表达体系中,都观察到GFP的绿色荧光,表明EB1c:GFP融合蛋白在两种瞬时表达体系中均成功表达,证明重组质粒构建成功。而且在烟草表皮细胞中进行瞬时表达时,通过对染色体进行染色,观察到EB1c:GFP融合蛋白和染色体定位相同,表明EB1c定位在烟草表皮细胞的细胞核中;用构建成功的重组质粒,通过浸花法浸染拟南芥,筛选,得到纯合的T3代转基因植株;与野生型植株作表型对比,二者一周龄的植株的根长没有显著性差异,二周龄时跟根长差异显著,抽薹时期差异不显著,果荚长度和株高有显著差异且转基因植株高于野生型植株;之后观察了拟南芥各组织中EB1c:GFP融合蛋白的表达,结果表明EB1c:GFP融合蛋白在拟南芥中表达是成功的,而且在根尖、气孔中具有表达,进一步证明重组质粒构建成功并且在拟南芥中成功表达。为了研究增强UV-B辐射对EB1c的影响,比较了在正常生长条件下和增强UV-B辐射条件下,WT组、EB1c:GFP组和eb1c组的根长、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、MDA含量,此外,还对根尖分生区有丝分裂后期、末期的有丝分裂细胞进行了观察。结果表明,eb1c组拟南芥的根长、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、MDA含量都对UV-B辐射增强最敏感,WT组次之,而EB1c:GFP组最弱。增强UV-B辐射条件,eb1c突变体的根尖分生区细胞在有丝分裂后期,表现出异常的有丝分裂现象;而野生型植株和转基因植株中没有发现染色体的异常分裂现象。但是,在有丝分裂的间期、后期,EB1c:GFP融合蛋白与染色体表现为共定位,表明增强UV-B辐射的条件下,eb1c插入突变体植株中有丝分裂后期染色体的异常分裂现象可能与EB1c基因功能的缺失相关。