研究背景和目的:动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,其特征是脂质的沉积和炎性细胞浸润[1,2]。诸多研究证据证明[3,4],炎症反应在动脉粥样硬化事件各个阶段内皆扮演着重要的角色,其最终导致了斑块的破裂及临床终末事件的发生。参与动脉粥样硬化的炎症细胞中,在趋化因子以及多种细胞因子的共同作用下,外周血单核细胞分化成巨噬细胞,然后迁移到动脉内膜[5,6],吞噬脂质后形成泡沫细胞,泡沫细胞的不断积累最后形成的脂质核心,与纤维帽及炎症因子共同组成了动脉粥样硬化斑块。这是动脉粥样硬化斑块的形成过程。在动脉粥样硬化的发生及斑块形成的过程中,巨噬细胞介导了多种炎症信号通路:如分泌的炎症介质可以激活TLR4信号通路诱导炎症反应,促进巨噬细胞的脂质沉积[7,8];核转录因子NF-κB信号通路是巨噬细胞起促炎反应的一个重要信号转导通路[9];巨噬细胞来源的CCL2能够通过一个正反馈调节机制诱导其他巨噬细胞的积聚[10,11],抑制BCL6可以加强巨噬细胞中CCL2在动脉粥样硬化中的作用,从而促进动脉粥样硬化的发生[12]。据此,以上的炎症信号通路研究结果均表明巨噬细胞及其参与的炎症反应在动脉粥样硬化发生发展过程中起着极其关键的作用。miR-155是非编码的微小RNA之一,位于人类21号染色体BIC(B-cell Integration Cluster)上[13]。最初研究发现其可表达于活化的免疫细胞并与免疫功能相关[14,15]。而近几年,我们发现miR-155与心血管疾病同样密切相关[16],尤其是在动脉粥样硬化发生发展以及导致终末事件的发生过程中。无论是在体还是体外研究均发现,miR-155在动脉粥样硬化的研究结果存在着诸多目前还难以解释的矛盾:(1)部分研究认为miR-155抑制炎症反应,减少粘附因子和趋化因子表达[17,18],从而减少炎症反应的发生,然而其他研究却显示出相反的结果[12,19]。(2)在动物研究中,miR-155-/-/LDL-R-/-双基因敲除模型小鼠[20]的研究结果显示,高脂饮食喂养下小鼠易形成动脉粥样硬化。但在miR-155-/-/Apo E-/-双基因敲除模型小鼠显示,miR-155的表达缺乏可明显下降巨噬细胞的炎症浸润程度及减慢动脉粥样硬化的形成[21]。新近的研究亦表明,过表达miR-155可增强炎症反应加强,促进泡沫细胞的形成,进而加速动脉粥样硬化的形成进程[12,22]。同样的矛盾在临床研究中亦有体现,Fichtlscherer[23]等临床研究结果显示在稳定型冠心病患者中,血清中miR-155的表达较正常人组下降。与之相反的是,有研究发现与正常人相比,血清中miR-155的表达水平在动脉粥样硬化小鼠及动脉粥样硬化患者中明显升高[22,24]。此外,有研究发现与非急性心肌梗死组相比,急性心肌梗死组(AMI)的miR-155的表达轻微升高[24]。这些在体内及体外miR-155研究的矛盾结果更加说明miR-155在动脉粥样硬化过程中作用的复杂性。分析其原因可能有:细胞层面:(1)特定的miRNA通过其互补位点可以与多种信使RNA(m RNA)结合,即一对多现象;(2)不同的m RNA可以与某特定的miRNA竞争结合,即多对一现象。(3)不同条件下的miRNA量的表达差异及miRNA间的互相作用等。在体层面:(1)不同的动脉粥样硬化阶段miR-155的作用不同,(2)不同的动物模型miR-155的作用不同。因此其具体作用机制仍有诸多不明之外,但目前在阐明其原因及机制相关方面的研究仍比较少,所以尚无法解释矛盾的具体形成原因。但尽管存在多种矛盾,由于miR-155与心血管疾病关系的密切性,其能否被作为新的生物标记物及治疗的靶点一直是重要的研究内容之一,所以值得我们进一步去研究及阐明。程序性细胞死亡因子4(PDCD4)是一种肿瘤抑制因子,其在人类的各种肿瘤的发生过程中扮演了重要的作用[25,26]。研究发现其在LPS诱导的TLR4相关的促炎信号信号通路中参与了其炎症反应过程,故被认为是个促炎蛋白,可能在炎症反应性疾病中起作用。Frederick F J[27]等发现,在巨噬细胞中,PDCD4可以通过激活转录因子NF-κB抑制白介素10的表达进而促进炎症反应。另外,其他研究亦显示PDCD4与心血管细胞生物学有着非常密切的关系。它可以抑制许多心血管细胞,如内皮细胞[28]、血管平滑肌细胞[29,30]、心肌细胞[30]和成纤维细胞[31]等增殖及诱导各种细胞的凋亡。在动脉粥样硬化中,cheng[28]等发现,高脂条件喂养下,相比于Apo E-/-基因敲除小鼠,PDCD4-/-/Apo E-/-双基因敲除小鼠可减少动脉粥样硬化斑块的区域。基于上述研究,我们猜测,在心血管疾病尤其是在动脉粥样硬化中,作为炎症因子的PDCD4在促进炎症反应和动脉粥样硬化的发展方面发挥了重要的作用。但具体调控机制仍不清楚。细胞因子信号转导抑制剂1(SOCS1)是众多SOCS蛋白家族一员,是一种重要的炎症负向调控因子之一,其主要是负向调控炎症因子的各种炎症反应,包括调控LPS诱导的炎症反应,TLR-4参与的炎症信号通路等[32]。SOCS1也可以通过抑制各种炎症细胞因子的产生,如TNF-α,IL-6,INF-γ[33]等,进而抑制炎症反应。另有研究显示SOCS1也是miR-155的目标靶基因[34],miR-155可以直接与SOCS1结合逆向调节巨噬细胞的炎症反应[35],而且巨噬细胞中miR-155也可以通过SOCS1信号传感器和活化的STAT3信号途径促进心脏肥大和功能的衰竭[36]。但miR-155及其与之相关的SOCS1/STAT3信号通路在动脉粥样硬化中的作用同样不明确,而且一些研究[37]认为相关的炎症机制的研究应该进一步补充阐明且有重要意义。本课题,我们拟探索miR-155和PDCD4在动脉粥样硬化小鼠主动脉组织和ox-LDL处理的RAW264.7细胞中的表达情况并阐明相互之间的关系。论证miR-155是否直接抑制SOCS1表达进而影响PDCD4在巨噬细胞中的表达,同时进一步的探讨了miR-155作用于PDCD4的具体机制。课题中我们将从动物实验及细胞实验两部分进行验证miR-155与PDCD4之间的关系,在动物实验中我们将建立实验相关的Apo E-/-小鼠动物模型,明确miR-155与PDCD4及其下游炎症因子,如IL-10,IL-6,TNF-α之间的关系,然后建立用ox-LDL刺激巨噬细胞,建立巨噬细胞粥样硬化模型,并应用腺病毒感染过表达SOCS1,转染si RNA沉默PDCD4、STAT3,antagomiR-155抑制miR-155等方法,运用油红O染色,荧光免疫标测,Western blot,Real-time PCR,ELISA等方法测定蛋白、基因及细胞共定位。最终验证miR-155可能通过SOCS1-STAT3-PDCD4轴促进巨噬细胞进炎症反应,进一步影响动脉粥样斑块的稳定性,进而导致斑块破裂,心血管事件的发生。理论上的佐证,希望能为临床动脉粥样硬化疾病的治疗提供新的思路和治疗靶点。方法:第一部分动物实验观察miR-155与PDCD4及各种炎症因子之间的关系动物实验C57野生型小鼠及Apo E-/-小鼠均统一购自南京大学动物中心,雄性,6周龄,体重17-20g。喂养饲料:C57野生型小鼠、Apo E-/-小鼠正常饮食组使用常规小鼠颗粒饲料;Apo E-/-小鼠高脂饮食组使用常规小鼠颗粒饲料混合(1.25%胆固醇和21%脂肪)。动物模型建立:随机分为5组,C57野生型小鼠组(n=10,常规饮料喂养),Apo E-/-小鼠正常饮食组(n=10,常规饮料喂养),Apo E-/-小鼠高脂喂养组(n=10,高脂喂养16周),Apo E-/-小鼠高脂喂养+Anti-NC组(n=10,高脂喂养16周),Apo E-/-小鼠高脂喂养+Anti-miR-155组(n=10,高脂喂养16周)。在购买并收到小鼠进行适应性喂养一周后,按照25毫克/公斤注射Anti-NC及Anti-miR-155试剂,对照组注射生理盐水,后继续培养,间距为36天,然后每周按量继续注射,再次注射9周,继续喂养1周,共22周后处死小鼠取小鼠的主动脉组织,石腊包埋和立即冰冻。应用油红O染色、HE染色、Masson染色、免疫组化等方法检测并评估斑块的稳定性;荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)测斑块中miR-155表达的位置;Western blot(WB)技术检测小鼠主动脉粥样斑块中SOCS1、p STAT3、PDCD4的蛋白表达情况;Real-time PCR技术检测动脉粥样斑块中miR-155的基因表达量;ELISA技术检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10三种炎症因子的蛋白表达水平。第二部分细胞实验观察miR-155调控PDCD4及各种炎症因子的表达变化细胞实验观察了ox-LDL刺激下的RAW264.7巨噬细胞中,miR-155与PDCD4及TNF-α、IL-6、IL-10三种炎症因子的表达变化。体外培养RAW264.7巨噬细胞株,用ox-LDL刺激RAW264.7细胞株以模拟动脉粥样硬化疾病的在体因素。使用Western blot、Real-time PCR技术观察不同浓度ox-LDL刺激下的miR-155与PDCD4的基因和蛋白表达变化,ELISA技术检测细胞中TNF-α、IL-6、IL-10三种炎症因子的蛋白表达水平。应用miR-155的抑制剂Anti-miR-155转染细胞后观察PDCD4的基因及蛋白表达变化,应用PDCD4的si RNA片段沉默PDCD4表达后观察TNF-α、IL-6、IL-10的基因及蛋白表达。阐述了ox-LDL刺激下的RAW264.7巨噬细胞中,miR-155调控PDCD4,以及PDCD4调控三种炎症因子表达的内在机制。第三部分细胞实验研究miR-155调控PDCD4及各种炎症因子的分子机制在第二部分实验基础上,我们进一步利用Targetscan网站对miR-155的靶点进行预测,显示SCOS1是miR-155的靶基因,我们设计SCOS1的3’UTR区段,并对其进行提纯、酶切、转染、测序及荧光报告基因检测后验证了SCOS1是miR-155的靶基因。然后应用腺病毒载体构建过表达SOCS1基因,并将其感染RAW264.7巨噬细胞,观察SCOS1/STAT3、PDCD4的基因及蛋白表达情况,同时运用转染技术将miR-155、Anti-miR-155、STAT3 si RNA转染至细胞中,观察SCOS1/STAT3信号通路及PDCD4炎症因子的变化情况。应用Western blot技术检测SCOS1/STAT3、PDCD4的蛋白表达情况,Real-time PCR技术检测基因的表达变化,以便观察miR-155调控PDCD4及各种炎症因子的内在分子机制。结果:第一部分动物模型中,抑制miR-155的表达可抑制PDCD4及各种促炎因子的表达动物实验结果显示,C57野生型小鼠、Apo E-/-小鼠正常饮食、Apo E-/-小鼠高脂喂养三组,miR-155的表达在Apo E-/-小鼠高脂喂养组最高,明显增加;三组间的IL-6、TNF-α的基因和蛋白表达趋势与miR-155的表达趋势相同,IL-10的基因及蛋白表达与之相反;相比于Apo E-/-小鼠高脂喂养组,Apo E-/-小鼠高脂喂养+Anti-NC组两者的炎症反应因子的表达无明显变化。应用FISH检测发现miR-155定位于主动脉及斑块中。比较Apo E-/-小鼠高脂喂养+Anti-NC及Apo E-/-小鼠高脂喂养+Anti-miR-155两组,油红染色发现Anti-miR-155干预组的斑块面积明显较Anti-NC组减少;Mason染色同样也发现Anti-miR-155干预组的斑块面积明显较Anti-NC组减少。此外,Anti-miR-155干预组主动脉组织中miR-155及CD68的表达显著受到抑制。进一步研究炎症信号相关通路时,我们发现Anti-miR-155干预组抑炎因子SOCS1表达增加,促炎因子p-STAT3表达减少,炎症因子PDCD4的表达亦减少。而作用于动物粥样硬化斑块并促进其形成的促炎因子IL-6、TNF-α在Anti-miR-155干预组表达受抑制,而IL-10在Anti-miR-155干预组的表达显著升高。以上研究说明在动物粥样硬化模型中,应用Anti-miR-155干预后,miR-155及炎症细胞的表达减少,促进炎症反应信号通路及促炎因子的表达受到抑制,如p-STAT3、PDCD4、IL-6、TNF-α,抑制炎症反应信号通路及保护性因子的表达受到得到加强,如SOCS1、IL-10。提示miR-155与斑块的发生、发展关系密切,且可能与SOCS1/p-STAT3、PDCD4信号途径有关,并调控各种炎症因子的表达。第二部分ox-LDL刺激的巨噬细胞中,miR-155调控PDCD4的表达并通过PDCD4调控各种炎症因子的表达细胞实验中,我们模拟体外高脂饮食构建模型中体内环境的变化情况,选择应用ox-LDL来刺激RAW264.7巨噬细胞株,构建实验用巨噬细胞模型并检测miR-155表达时发现,miR-155的表达与ox-LDL刺激的浓度及时间相关,呈浓度依赖性及时间依赖性,这与动物实验中的Apo E-/-小鼠高脂喂养组比Apo E-/-小鼠正常饮食喂养组及野生小鼠的miR-155表达要高的实验结果一致;同时检测PDCD4及IL-6、TNF-α、IL-10炎症因子时我们也发现了和动物实验近乎一致的结果。为证明miR-155与PDCD4及三种炎症因子的关联性,我们在ox-LDL刺激的RAW264.7巨噬细胞内转染了Anti-miR-155观察PDCD4基因及蛋白表达时发现,转染Anti-miR-155后,miR-155被抑制的同时,PDCD4基因及蛋白表达亦受抵制,说明巨噬细胞内miR-155可以调控PDCD4的表达;在该模型下进一步应用PDCD4 si RNA沉默PDCD4表达后发现,转染Anti-miR-155所致的TNF-α、IL-6、IL-10的表达变化,在转染PDCD4 si RNA后可部分翻转,说明miR-155引起的巨噬细胞内TNF-α、IL-6、IL-10的表达变化部分是通过PDCD4途径来实现。第三部分ox-LDL刺激的巨噬细胞中,miR-155通过SOCS1/p-STAT3途径调控PDCD4的表达我们首先验证了SCOS1是miR-155的靶基因,直接在细胞内转染miR-155后,SOCS1的基因表达明显受抑制。然后我们观察了转染后的SOCS1/p-STAT3的表达变化,发现当细胞内miR-155表达增加后,SOCS1作为靶基因其表达受抑制外,其下游的重要促炎信号通路STAT3的磷酸化明显加强,p-STAT3增加,说明miR-155的增加可促进炎症信号通路的信号放大。而在转染Anti-miR-155进入巨噬细胞后,SOCS1/p-STAT3及PDCD4的表达明显受抑制。在前细胞实验中我们也发现,ox-LDL刺激巨噬细胞中,转染了anti-miR-155也可抑制PDCD4表达水平。以上结果说明巨噬细胞中miR-155、SOCS1/p-STAT3及PDCD4三者间存在着关联。为清楚上述间炎症因子的相关性及内在机制,进一步实验中我们应用腺病毒过表达SOCS1基因,用STAT3 si RNA沉默STAT3的表达,监测SOCS1/p-STAT3及PDCD4的基因及蛋白表达变化情况。实验结果显示,RAW264.7巨噬细胞中,ox-LDL+过表达SOCS1组与ox-LDL刺激组相比,ox-LDL所致的p-STAT3及PDCD4高表达效果在转染SOCS1后明显受抑制;同样在ox-LDL刺激时转染STAT3 si RNA,相比于ox-LDL刺激组亦出现了上述相同的结果。因此,我们认为ox-LDL刺激的巨噬细胞中,miR-155可通过SOCS1/STAT3的信号途径促进PDCD4的表达。研究结论:1.在动物水平发现,miR-155发挥促进动脉粥样硬化以及斑块形成的作用,下调miR-155表达可显著抑制小鼠体内的动脉动脉粥样硬化斑块的形成和炎症反应。2.在细胞水平发现,ox-LDL上调RAW264.7细胞中miR-155的表达,进而促进炎症因子的释放,而抑制miR-155则可逆转ox-LDL介导的RAW264.7细胞炎症因子释放。其主要机制是通过调控SOCS1-STAT3-PDCD4轴,进而影响巨噬细胞的炎症反应。其可望成为减缓动脉粥样硬化以及抑制斑块形成的潜在靶点。