细胞周期末期促进复合物及其调节亚基Cdh1在神经干细胞增殖分化中的作用

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cjc013
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研究背景和目的神经干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,是近十几年来移植治疗中枢神经系统疾病的研究热点。不论是内源性再生的神经干细胞,还是外源性移植的神经干细胞,其在损伤周围区域的存活、分化及能否建立有效的功能整合,是影响神经功能恢复的关键因素。本课题组前期研究发现IκBα突变型基因可通过下调永生化神经干细胞中NF-κB的活性,降低部分炎性细胞因子的表达,提高永生化神经干细胞对缺氧缺糖环境的耐受性,但是其对细胞分化及神经功能恢复无显著改善。Cdh1是细胞周期末期促进复合物(anaphase promoting complex,APC)的调节亚基,在增殖细胞中,它通过泛素化降解特定的底物蛋白起着调控细胞周期的作用。近年来研究发现其在成熟神经元中有大量表达,具有调节神经元轴突生长、突触传递及神经元存活的作用。但是,目前关于APC-Cdh1在神经干细胞增殖分化、神经损伤等中枢神经系统其他方面的作用,尚不清楚。神经干细胞增殖分化与细胞周期密切相关。一方面,神经元即是由神经干细胞出细胞周期分化而成:另一方面,Cdh1在细胞周期的作用主要是维持细胞处于G1期,因此,我们推测Cdh1与神经干细胞分化有关。本研究我们拟通过体内外实验观察Cdh1在中枢神经细胞中的表达分布特点,体外培养大鼠神经干细胞,观察ATRA诱导神经干细胞向神经元分化时Cdh1的表达变化规律;再通过筛选Cdh1 RNA干扰有效靶点,构建Cdh1 RNA干扰慢病毒载体,探讨Cdh1下调对神经干细胞增殖分化的影响,从而进一步认识Cdh1在中枢神经细胞中的作用,为选择Cdh1作为中枢神经系统疾病基因治疗的靶点提供实验依据。研究方法与结果1.APC-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点方法:取健康成年雄性SD大鼠脑部制作冰冻切片,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位,分别用抗神经元核(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双标检测Cdh1表达的细胞定位情况。取出生24h内乳鼠,原代培养神经元及神经干细胞。免疫组化检测NeuN进行神经元鉴定。Nestin染色进行神经干细胞初步鉴定,加入胎牛血清诱导其分化,免疫组化染色检测GFAP和MAP2的表达鉴定神经干细胞的分化特性。分别提取神经干细胞与成熟神经元总RNA,采用实时定量PCR检测APC两个调节亚基Cdh1与CDC20的表达。结果:大鼠脑组织切片免疫组化DAB染色显示Cdh1在海马、皮层均有大量表达,免疫荧光双标显示Cdh1表达主要定位于神经元中,星形胶质细胞表达较少。原代培养的神经元光镜下可见胞体和较长的细胞突起,NeuN免疫染色为阳性,纯度达90%以上。原代神经干细胞培养至第4~5 d即形成神经球,Nestin染色鉴定为阳性,并能分化为神经元和星形胶质细胞。实时定量PCR检测显示与神经干细胞相比,神经元中Cdh1 mRNA表达升高(1.00±0.05 vs 2.10±0.07,P<0.05),但CDC20 mRNA几乎没有表达(1.00±0.04 vs 0.02±0.01,P<0.05)。2.全反式维甲酸诱导原代神经干细胞分化时Cdh1表达的变化方法:取出生24h内乳鼠,原代培养神经干细胞。当培养至第3代时,将神经球接种在预先用0.001%多聚鸟氨酸包被的培养皿中,加入ATRA诱导分化。分为3组:对照组、1μmol/L ATRA组、10μmol/L ATRA组,对照组中仅加入等量的DMSO,其终浓度为0.1%。于诱导开始时、诱导第4天、第8天提取细胞总RNA,采用实时定量PCR检测Cdh1的表达;于诱导第8天,采用免疫细胞化学检测MAP2和GFAP的表达观察神经干细胞向神经元与星形胶质细胞分化情况;采用实时定量PCR检测1μmol/L ATRA诱导神经干细胞分化时Id2 mRNA表达变化。结果:免疫细胞化学检测显示,对照组、1μmol/L ATRA、10μmol/L ATRA诱导组神经干细胞分化为MAP2阳性神经元的比例依次为(19.1±2.8)%、(41.4±0.8)%、(34.3±1.0)%(P<0.05),其中以1μmol/L ATRA组神经元分化比例最高。与诱导开始时相比,诱导第4天、第8天对照组Cdh1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),1μmol/L ATRA组与10μmol/L ATRA组Cdh1 mRNA表达均升高(P<0.05),且以1μmol/L ATRA组在诱导第8天Cdh1 mRNA表达最高(P<0.05)。1μmol/L ATRA诱导过程中,诱导第4天、第8天神经干细胞Id2 mRNA表达均较诱导开始时降低(P<0.05)。3.大鼠Cdh1基因RNA干扰有效靶点的筛选方法:根据大鼠Cdh1基因的编码序列设计3个干扰序列及对照序列,根据pENTR/H1/TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTR/H1/TO线性载体上,形成完整载体,挑取阳性菌落扩增培养,送生物公司进行测序鉴定。采用脂质体法分别将测序鉴定成功构建的3个干扰载体和对照载体转染大鼠永生化神经前体细胞,同时转染含绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒作为对照,评价基因转染效率。转染后48h提取细胞总RNA,采用实时定量PCR检测Cdh1 mRNA的表达。结果:经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组载体大小正确,约为3kb。经DNA测序鉴定构建的3个干扰载体和对照载体插入的序列均正确,无碱基突变或缺失。细胞转染后24h、48h荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白阳性表达的细胞,即为成功转染的永生化神经前体细胞,转染后24h与48h细胞转染效率分别为(54±5)%、(36±4)%。与转染对照载体相比,转染3个干扰载体细胞Cdh1的表达分别为1.15±0.31、0.37±0.06、0.51±0.08,以第2个干扰载体下调作用最为明显(P<0.05)。4.大鼠源性Cdh1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定方法:针对已经筛选确定的Cdh1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-Cdh1 RNAi慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0(含gag/pol元件)载体、pHelper 2.0(含VSVG元件)载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,浓缩后分装。采用逐孔稀释滴度测定法将其感染293T细胞,根据GFP蛋白的表达水平计算病毒滴度。分别将LV-Cdh1 RNAi慢病毒及对照慢病毒感染PC12细胞,于感染后72h,提取细胞总RNA和总蛋白,分别采用RT-PCR及western blot检测Cdh1的表达。结果:经PCR和测序证实,成功构建Cdh1基因RNA干扰的慢病毒载体LV-Cdh1RNAi。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为7×10~8TU/ml。RT-PCR及western blot检测显示感染LV-Cdh1 RNAi慢病毒的PC12细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞Cdh1表达明显降低(P<0.05)。5.慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞增殖分化的影响方法:原代培养神经干细胞至第3代,采用含绿色荧光蛋白(GFP)的对照慢病毒,分别以MOI值=1、5、10、20、50和100进行慢病毒感染,感染后72h采用荧光显微镜观察GFP的表达,确定慢病毒感染神经干细胞合适的MOI。再选择MOI=20进行慢病毒感染,分为未感染组、对照慢病毒感染组(LV-control组)、Cdh1 RNA干扰慢病毒感染组(LV-Cdh1 RNAi组)。分别于感染后24h、48h、72h采用MTT法检测Cdh1 RNA干扰慢病毒感染对神经干细胞增殖的影响。于感染后72h,采用2%胎牛血清诱导分化,4d后提取细胞总蛋白,采用western blot检测MAP2和GFAP的表达,观察慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞分化的影响。结果:慢病毒感染神经干细胞合适的MOI为10~50。MTT检测发现,感染后24h、48h LV-control组与LV-Cdh1 RNAi组吸光度较末感染组增加(P<0.05),但两组间差异无统计学意义;感染后72h,LV-Cdh1 RNAi组较LV-control组及未感染组吸光度均增加(P<0.05)。Western blot检测显示LV-Cdh1 RNAi组MAP2表达较LV-control组及未感染组降低(P<0.05),三组GFAP表达差异无统计学意义(P>0.05)。6.统计学处理采用SPSS12.0软件进行统计学分析,计量资料采用(?)±s表示,两组间比较采用t检验,三组间比较采用方差分析;计数资料采用率表示,组间比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结论1.APC-Cdh1在大鼠脑组织中有大量表达,且主要定位于神经元;体外实验表明神经元中Cdh1表达高于神经干细胞。2.ATRA成功诱导神经干细胞向神经元分化,1μM ATRA诱导时,神经元分化比例最高,伴有Cdh1 mRNA表达上调,及其下游底物Id2 mRNA的表达下调。3.采用永生化大鼠神经前体细胞及pENTR/H1/TO中间载体系统,成功筛选出Cdh1RNA干扰的有效作用靶点。4.成功构建大鼠源性Cdh1基因RNA干扰慢病毒载体,包装的慢病毒滴度为7×10~8TU/ml,在mRNA及蛋白质水平上,均能有效下调Cdh1的表达。5.慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰能促进神经干细胞增殖,抑制其向神经元方向分化。研究总结本课题首先通过体内外实验揭示Cdh1在不同神经细胞中的差异性表达,即Cdh1主要表达在神经元,星形胶质细胞与神经干细胞表达较少。再通过ATRA诱导神经干细胞分化为神经元,发现Cdh1 mRNA的表达随着神经元分化比例的增高而升高,提示Cdh1参与神经干细胞向神经元方向的分化。然后通过筛选Cdh1基因RNA干扰有效靶点,构建Cdh1 RNA干扰慢病毒载体,观察慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞增殖分化的影响,发现Cdh1的表达下调会促进神经干细胞的增殖,抑制其向神经元的分化,进一步明确了Cdh1在神经干细胞分化中的作用。本研究加深了对Cdh1在中枢神经系统作用的认识,表明其在神经细胞发育分化中的可能起着重要作用,为下一步探讨Cdh1在神经损伤后再生修复及基因治疗中的作用奠定了基础。
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