地质事件和气候波动是影响物种遗传变异格局两个重要驱动因子。地质事件导致的生物原有栖息地地形外貌的改变,形成一些阻碍种群扩散的障碍(如:山脊、河谷及平原等),引起种群之间基因流减少,从而导致种群遗传结构产生分化。气候波动同样影响物种种群遗传结构和有效种群大小。气候的波动在更新世(Pleistocene)冰期尤为剧烈,特别是在末次盛冰期(Last Glacial Maximum),这个时期的冰川作用最为强盛,其发挥的相关作用也最强。在寒冷的冰期,冰川或者低温促使物种往南方或者低海拔区域退缩,躲进温暖的生物避难所,不同区域避难所中的种群由于栖息地丧失、基因流减少、遗传漂变、自然选择等因素的影响导致有效种群大小减少和遗传分化;在温暖的间冰期,物种从避难所扩张出来开拓新的生存区域,不同避难所扩张的种群可能在地理上发生接触,表现为有效种群大小增加和二次接触。这种收缩扩张的生存模式,反应在种群历史动态上,并且其种群遗传结构也会发生相应改变。这两种驱动因子在影响物种遗传变异模式上某一个会占据主导地位,有时也会共同起作用。通常可以通过它们留下的不同遗传印记来判断其影响作用。如果地质事件影响物种遗传变异格局,那么物种的种群遗传支系分化时间通常和古老的地质事件发生时间相吻合。如果更新世气候波动影响物种遗传变异格局,那么物种种群遗传支系分化时间通常和气候事件发生时间相吻合,并且物种的有效种群大小会随着气候波动而产生变化。目前相关的研究主要集中在北美和欧洲,并发现了地质事件和气候波动对物种遗传变异格局影响的区域一致性结论。然而,相关研究在具有丰富生物多样性的中国西南地区相对缺乏且存在争议。争议点主要在地质事件和气候波动对物种遗传变异格局影响的贡献大小和机制上。中国西南紧邻青藏高原,伴随青藏高原隆升,此区域形成了复杂的地形地貌结构。物种的种群遗传结构有可能受到地形地貌改变的影响而发生分化。而在更新世冰期,该区域并没有大规模冰川覆盖,相对温和的环境和复杂的地形为物种提供了稳定的栖息地环境。因此有可能更新世气候波动相对于地质事件对中国西南山地物种遗传变异格局影响较小。目前需要更多研究揭示该地区发生的地质事件和气候波动对物种遗传变异格局的影响和机制。华西雨蛙(Hyla annectans)主要分布在中国西南地区海拔580-2500米的山区稻田附近。其具有环境敏感度高,扩散能力弱以及世代周期短等特征,这使其成为探讨地质事件和气候波动影响物种遗传变异格局的良好研究对象。目前大部分此类研究主要基于线粒体,微卫星和少量的核基因序列。相比于传统分子标记,简化基因组测序SLAF-seq(Specific Length Amplified Fragment Sequencing)得到的大量分子标记能为我们提供更多更准确的遗传信息。我们共采集了覆盖华西雨蛙中国分布区的35个地理种群349个成体样本,采用SLAF-seq获得分子标记并结合物种分布模型探究华西雨蛙种群遗传变异格局的现状以及地形地貌改变和更新世气候波动对华西雨蛙种群遗传变异格局的影响,获得以下研究结果:(1)简化基因组测序选定限制性内切酶为HaeⅢ+Hpy166Ⅱ,酶切片段长度在414-444bp。酶切效率为89.38%,测序平均Q30为82.78%,平均GC含量为42.06%,显示得到较好的测序结果。共获得478.65M reads数据,平均深度是5.53倍。原始数据包括1 075 515个SLAF标签,其中230 236个是多态性的,扩增得到总的SNPs(单核苷酸多态性)数量为2 303 646个。过滤掉最小等位基因频率(MAF,Minor Allele Frequency)低于0.05,以及在整个35个群体中缺失数据超过20%或在每35个群体中超过40%的SNP,共获得8420个符合条件的SNPs用于种群遗传学分析。(2)我们用观测杂合度和期望杂合度两个指标评估遗传多样性。观测杂合度和期望杂合度范围分别为0.019-0.103和0.026-0.169。华西雨蛙种群遗传多样性展现了较大的差异,遗传多样性最高的种群分布在武陵山脉和云贵高原中东部,而四川西部和横断山脉种群遗传多样性最低。这可能反应了其种群历史和种群大小的不同。(3)我们利用筛选得到的8420个SNP进行种群结构AMOVA、遗传分化指数FST、系统进化树、Faststructure、PCA、DAPC以及基因流分析。结果表明华西雨蛙呈现高的种群遗传分化水平,AMOVA和遗传分化指数FsST结果显示,种群间呈现显著遗传分化,除了两个地理距离邻近的种群配对(10-11和33-34)FST值不显著外,其他种群配对FST值范围为0.103-0.953都为显著水平(P<0.001)。并且遗传分化和表型分化结果相符,七个遗传支系间(E、C1、C2、N1、N2、W1和W2,详见下面遗传支系描述)在表型和遗传上都具有显著分化:遗传上,七个支系之间的FsST值范围为0.260-0.909都为显著水平(P<0.001)且核基因流较弱;表型上,虽然在体重和体长上并没有发现明显差异,但是以黑色斑点数量为代表的表型性状在支系之间具有显著差异。种群的遗传变异主要来源于种群间,AMOVA分析显示种群间遗传变异显著大于种群内遗传变异(70.98%,P<0.001)。综合系统进化树、Faststructure、PCA和DAPC的检测结果,将35个分布于中国西南山地的华西雨蛙地理种群分为7个遗传支系:E支系包含110个个体分布在武陵山脉,C1、C2支系包含30和40个个体分布在云贵高原中东部,N1、N2支系包含29和20个个体分布在四川西部,W1支系包含90个个体分布在横断山脉,而W2支系包含30个个体分布在云南西部的哀牢山,7个支系互为单系群。另外PCA检测结果还是显示E、N2和W1支系可能具有种群亚结构。(4)另外我们采用IBD(Isolation by Distance)模型分析华西雨蛙遗传距离和地理距离相关性,结果表明遗传距离与地理距离呈显著正相关(相关系数是r2=0.453;P<0.001)。说明地理距离是其种群遗传分化的重要因素。(5)为了探讨地质事件和支系分化的关系,我们基于前人研究华西雨蛙最近共同祖先(tMRCA)时间为4Mya,使用2130个缺失率小于95%的SNP在SNAPP软件中计算支系分化时间。7个遗传支系的分化时间从3.89Mya到1.73Mya:第一次分裂为E支系和其他支系在3.89Mya分化;第二次分裂为支系C与支系N和W在3.12Mya分化;之后支系N和支系W在2.67Mya分化;而后支系内部的分化时间分别为,支系C1和C2之间在2.77Mya分化;支系N1和N2在2.12Mya和支系W1和W2之间在1.73Mya分别分化。遗传支系的分化时间对应最近青藏高原东部区域的后续运动和云贵高原的抬升时间。比如有研究表明:横断山脉重大构造事件发生在3.4百万年前;2.5-1.2百万年前青藏高原东南部边界沿龙门山-大相蛉-锦屏山-玉龙山-碧罗雪山一线在上新世晚期有较强烈的活动;云南西部的山脉,如大雪山、高黎贡山、怒山等山脉,在中新世之后至上新世晚期前这段时间快速隆起达到了它们的最高海拔等。(6)为了探讨气候波动是否影响华西雨蛙过去种群数量变化和栖息地分布,我们随机挑选60个拥有6-8个变异位点的SLAF标签,随机分为3组,运行BEAST软件中的EBSP(Extended Bayesian Skyline Plots)分析探讨华西雨蛙过去种群数量变化。结果显示随着时间改变,7个支系的有效种群大小并未发生变化。说明华西雨蛙种群数量在过去保持稳定。为了探讨物种栖息地在过去的分布情况,我们采用134个华西雨蛙现有分布点数据,并从19个气候因子中筛选出7个Pearson相关性值小于0.8的气候因子,用MAXENT模型模拟华西雨蛙在中国西南地区的分布状况(末次盛冰期,LGM,Last Glacial Maximum,～0.021Mya;末次间冰期,LIG,Last Interglacial,0.12-0.14Mya)和当前的栖息地分布状况。模型结果表明,华西雨蛙现今分布区域与本文采样区域吻合,且华西雨蛙从LIG和LGM到现在,物种的适宜分布范围并未发生大的改变。综上所述,通过大规模采样和简化基因组测序以及物种分布模型的构建,我们发现地质事件在影响华西雨蛙遗传变异模式上扮演了重要角色。遗传支系的分化时间对应最近青藏高原东部区域的后续运动和云贵高原的抬升时间,说明山脉的隆起产生的屏障导致了支系之间的分化。相反,更新世气候波动对物种遗传变异格局的影响相对较弱。7个支系的有效种群大小在历史上保持稳定,适合栖息地范围也没发生明显变动。其原因可能是在更新世冰期,中国西南相对温和的气候条件,生活区域复杂地理结构为其应对气候波动提供了足够的缓冲。这类因地质事件影响种下水平遗传变异,并且在更新世冰期种群保持稳定的模式在同区域的其他物种研究中也得到证实。因此,地质事件相较于更新世气候波动是驱动中国西南山区物种遗传变异模式的主要因素。我们的研究不仅突出展现了地质事件和更新世气候波动对驱动物种遗传变异格局的相对作用,也助于理解中国西南山区物种遗传变异格局的形成机制。