免疫缺陷动物模型在免疫、感染、肿瘤和再生医学等研究中有很高的应用价值，目前应用最广泛的是免疫缺陷小鼠。但因为小鼠与人类遗传背景和生理指标差异较大，加之其体型小、寿命短，不利于手术操作和长期跟踪等缺点，局限了免疫缺陷小鼠在临床前研究中的应用。猪在生理、生化等方面与人类更接近，猪体型适中，寿命较长，并且，猪的免疫系统与人类的相似度极高，被认为是研究人类免疫的更好的模型。因此，免疫缺陷猪模型的应用，可克服小鼠模型的以上缺点。但是，有关免疫缺陷性猪模型的报道较少。　　重组激活基因(Recombination activating gene，RAG)是T、B淋巴细胞成熟的关键基因。在小鼠中，RAG功能的缺失，能引起成熟T细胞和B细胞同时缺失，导致重症联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)。本研究采取与制备这种SCID小鼠相同的思路，通过敲除猪的RAG建立免疫缺陷猪模型，为生物医药研究提供更理想的动物模型。　　在本实验的初期，我们首先用传统的同源重组技术对猪RAG基因进行打靶。用构建的同源重组打靶载体转染巴马猪胎儿成纤维细胞，在所鉴定的306个克隆中，没有得到阳性细胞系。之后我们采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术尝试对RAG基因进行敲除。巴马猪胎儿成纤维细胞转入ZFNs载体后，虽然获得了阳性细胞系，但打靶效率并不高，在鉴定的263个细胞克隆中，只有2个(0.08％)细胞系发生了敲除。　　随后我们采用了设计更简单、打靶效率更高的TALEN(Transcriptionactivator-like effector nuclease)技术，对猪RAG基因的敲除进行了更为深入和全面地研究。我们首先将构建的针对RAG的TALEN载体的打靶效率在孤雌胚胎进行了验证。然后选取打靶效高的TALENs载体用于巴马猪胎儿成纤维细胞基因打靶。在我们鉴定的181个对RAG1进行敲除的细胞系中，69个克隆含有基因打靶细胞，打靶效率高达38.1％，并且14个(7.7％)克隆发生了双等位基因（纯合）敲除。我们也用TALENs对RAG2基因进行了打靶，在鉴定的454个克隆中，也获得了高达22.9％的敲除效率，并有6个(1.3％)克隆是纯合敲除细胞系。　　我们选取TALEN技术获得的6个RAG1纯合敲除克隆、5个RAG2纯合敲除克隆、1个RAG1和4个RAG2杂合敲除克隆作为核供体，进行体细胞核移植。重组胚移植入24头代孕母猪，其中13头怀孕到期并自然分娩。我们一共获得27头存活克隆猪，其中9头为RAG1纯合敲除猪，3头为RAG2纯合敲除猪，10头为RAG2单等位基因（杂合）敲除猪。　　所获得的杂合敲除猪，在普通的饲养环境中，生长发育正常，并能够繁殖后代;但纯合敲除猪生长明显缓慢，并且在出生不久后陆续死亡，最长存活时间没有超过30天。我们对RAG1或RAG2(RAG1 or RAG2，RAG1/2)纯合敲除猪分别进行了分析，与对照的野生型猪相比，RAG基因敲除猪的胸腺严重发育不全，很小或消失;脾脏变薄，组织切片观察，没有明显的淋巴细胞聚集区;外周血、胸腺、骨髓和脾脏中未发现成熟的T细胞和B细胞，V(D)J重组也消失。RAG基因敲除猪呈现明显的重症联合免疫缺陷表型。我们也发现，RAG1和RAG2的纯合敲除猪表型一致，均可作为免疫缺陷猪模型。　　综上所述，本研究通过结合TALEN技术与体细胞核移植技术，成功建立了RAG1/2基因敲除的重症联合免疫缺陷猪模型。这种SCID猪将可应用在与肿瘤、免疫和再生医学等相关的基础和临床研究中，从而成为生物医学研究的重要工具。