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托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TAs）是临床上广泛应用的抗胆碱药物,是一种主要存在于茄科植物的次生代谢产物。市场上使用的托品烷生物碱主要依赖于从植物中提取,产量低价格昂贵,因此利用代谢工程手段提高植物中托品烷生物碱的产量具有十分重要的意义。基因工程的发展使得运用代谢工程手段改造TAs生物合成途径成为可能,而代谢工程手段的应用依赖于对托品烷生物碱代谢途径的生物化学和分子生物学研究。马尿泡（Przewalskia tangutica）是一种传统的藏药植物,多生于青藏高原。其根中含有丰富的莨菪碱（主要生物碱成分）,莨菪碱的含量为干重的1.67%-3.83%,总生物碱含量为干重的2.06%-4.01%,是理想的TAs药源植物之一。目前为止,关于马尿泡中托品烷生物碱生物合成途径基因的研究还鲜有报道。托品酮还原酶（Tropinone reductase,TRs）分为托品酮还原酶I（Tropinone reductase I,TRI）和托品酮还原酶II（Tropinone reductase II,TRII）。托品酮还原酶I和II作为生物碱合成途径上的一个分支点,分别将托品酮还原成托品和假托品。托品是托品烷生物碱分子结构中托品环的直接来源,而假托品作为分支途径,使托品酮流向了其他的次生代谢产物。本研究以马尿泡为研究对象,分析比较其他已报道的茄科物种托品酮还原酶基因序列,利用RACE技术,克隆得到了PtTRI和PtTRII。PtTRI的cDNA全长为1176 bp,包含822 bp的编码区,编码274个氨基酸,70 bp的5′UTR和284 bp的3′UTR,终止密码子为TGA。PtTRII的cDNA全长为981bp,包含783 bp的编码区,编码261个氨基酸,87 bp的5′UTR和111 bp的3′UTR,终止密码子为TAA。经过GC-MS鉴定重组PtTRI和PtTRII体外催化产物,结果表明PtTRI和PtTRII具有生物学功能,能够分别将托品酮分别还原为托品和假托品。在大肠杆菌Rosetta菌株中异源表达PtTRI和PtTRII,对其进行了酶动力学分析。PtTRI还原反应最适pH为6.4,这也接近植物细胞的生理pH点,而氧化反应最适pH为10.6。PtTRI催化托品酮的Km和Kcat/Km分别为0.52±0.10 mM,42.26 s-1·mM-1。PtTRI催化托品的Km为0.07±0.00 mM,Kcat/Km为100.11 s-1·mM-1。结果显示PtTRI对底物托品有一个更高的亲和力和催化能力,但是其酶动力学测定是在pH 10.6进行的,属于强碱性环境,而植物细胞处于弱酸性环境,所以在马尿泡体内主要是还原反应占主导优势。PtTRII还原反应最适pH为6.8,而PtTRII对托品酮的Km为0.087±0.02 mM,Kcat/Km为116.90 s-1·mM-1,说明PtTRII对托品酮的亲和力和还原活性远高于PtTRI。PtTRI与其他物种中的托品烷生物碱相关基因如PMT、H6H等显示出相似的组织表达特征,在根中大量表达,而在叶片和茎中少量表达。PtTRII则在根和茎的表达量都很高。PtTRI的表达模式说明了地下部分是TAs合成的主要场所,地上部分有可能也参与了TAs的合成。本文通过对PtTRI和PtTRII功能的研究,同时比较马尿泡与其他茄科物种如铃铛子、曼陀罗等植物中托品酮还原酶I的催化活性,结果表明马尿泡托品酮还原酶I是具有很高的还原活性,这一结果可为托品烷生物碱合成代谢调控提供新思路。