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缺血性脑血管病是威胁人类健康的主要疾病之一。脑缺血后继发脑水肿、颅内压增高甚至脑疝形成是致残、致死的重要原因。
脑水肿形成的解剖学基础是血脑屏障完整性的破坏,血管内水分进入脑组织。而脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)是血脑屏障的最重要组成部分。BMEC的紧密连接与细胞外基质、星形胶质细胞终足一起,构成了血脑屏障的主要结构基础。BMEC不仅参与构成血脑屏障,而且多种生物活性物质由BMEC产生及分泌,这些物质具有调节血管张力、血液流动性和粘附性等功能,对维持正常血液循环至关重要。BMEC损伤是脑血管病特别是缺血性脑血管病的早期病变和基本动因,与脑血管病发生发展密切相关,因此保护BMEC的结构和功能完整显得尤为重要。
目前,对脑缺血损伤机制的研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、线粒体的损伤、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,缺血后的炎症反应尤为重要,它能促进继发性脑损害,加重脑损伤,是脑缺血损伤的主要原因之一。活化的BMEC在转录因子,特别是核转录因子-κ B(nuclearfactor-kappa B,NF-κB)系统的调节下,产生一系列细胞因子,如细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),这些因子介导或直接参与白细胞和BMEC的粘附,进而帮助其跨越BMEC,浸润至缺血脑组织。
流行病学调查结果显示,女性(尤其是绝经前)的缺血性脑血管病发病率远低于男性,而绝经后的发病率则显著上升。另外绝经后女性的失眠、焦虑等神经系统表现明显增多。据此认为,雌孕激素可能参与了脑血管病的发生和发展。国内对黄体酮神经系统作用的研究开展较少;国外研究多局限于外周神经损伤、脑外伤等领域,对黄体酮脑缺血保护作用机制的研究则处于起步阶段,特别是对其保护血脑屏障、减轻缺血后微血管内皮细胞损伤机制的研究尚未见报道。
第一部分体外构建大鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺模型及黄体酮的保护作用
目的:体外研究氧糖剥夺对大鼠脑微血管内皮细胞的损伤机制及黄体酮的保护作用,以探讨黄体酮保护血脑屏障的可能机制。
方法:体外培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC),并构建氧糖剥夺(oxygen andglucose deprivation,OGD)模型。流式细胞技术检测BMEC在OGD后ICAM-1、VCAM-1的表达情况。利用Western blot方法检测大鼠BMEC氧糖剥夺后核蛋白NF-κB p65亚基含量,染色质免疫沉淀分析(Chromatin immunoprecipitation assaykit,ChIP)技术检测NF-κB的DNA结合活性。并以3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT]法检测BMEC存活率,比色法测定乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)漏出率反映细胞损伤程度。为了反映BMEC的氧化应激损伤水平,利用生物化学法测定细胞培养液中及细胞内丙二醛(malondialdelyde,MDA)水平及细胞内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性。
结果:OGD后6h可诱导BMEC的NF-κB、ICAM-1、VCAM-1表达上调,黄体酮对此有明显抑制作用。氧糖剥夺能显著提高NF-κB的DNA结合活性。黄体酮对此有明显抑制作用。OGD6h明显降低BMEC的存活率,并增加LDH释放率。OGD6h可明显增加BMEC培养基中及细胞内MDA含量,减少BMEC内SOD、GSH-Px活性。与氧糖剥夺组相比,黄体酮可明显降低培养基中和细胞内的MDA含量、提高BMEC内SOD、GSH-Px活性。
结论:OGD可通过活化NF-κ B、上调ICAM-1和VCAM-1的表达、诱导氧化应激等途径损伤BMEC。黄体酮能减少OGD对BMEC造成的损伤。
第二部分黄体酮对大鼠局灶性脑缺血后血脑屏障的保护作用
目的:研究黄体酮对局灶性脑缺血后血脑屏障的保护作用。
方法:利用大脑中动脉栓线阻断法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造成大鼠局灶性脑缺血损伤模型,通过氯化四唑(tetrazolium chloride,TTC)染色测定梗死体积、伊文氏蓝染色反映血脑屏障破坏情况。应用反转录多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot技术检测血脑屏障连接粘附分子-A(junctional adhesion molecule-A,JAM-A)基因及蛋白水平的表达。
结果:黄体酮能有效减少脑梗死体积和血脑屏障的破坏;黄体酮能在基因和蛋白水平阻断JAM-A的下调。
结论:黄体酮能通过阻断JAM-A的下调减少脑缺血后血脑屏障的破坏,减小脑梗死体积。
第三部分黄体酮对脑缺血后炎症细胞浸润和突触重建的作用
目的:研究黄体酮在大鼠局灶性脑缺血后对炎症细胞浸润及突触重塑的作用。
方法:利用大脑中动脉栓线阻断法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造成大鼠局灶性脑缺血损伤模型。通过检测CD68表达和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,分别反映单核巨噬细胞及中性粒细胞在缺血半暗带的浸润情况。利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法检测缺血侧海马CA1区生长相关蛋白-43(growth-associated protein43,GAP-43)和突触素(synaptophysin,SYP)的表达,以反映突触可塑性变化。
结果:黄体酮能有效减少梗死后缺血半暗带内CD68和MPO的表达;黄体酮能显著增加缺血侧海马CA1区GAP-43和SYP的表达。
结论:黄体酮能显著减少大鼠脑梗死后缺血半暗带内单核巨噬细胞及中性粒细胞的浸润;同时,黄体酮能够通过增加GAP-43的表达,来刺激突触素SYP表达的增加,进而促进缺血后海马CA1区突触的重建。