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背景和目的:CD4+T辅助细胞是引起结节病免疫病理损伤的重要因素之一;近年来已把CD4+T辅助细胞从传统的Thl细胞、Th2细胞亚群拓展到Thl细胞、Th2细胞、Th17细胞和调节T细胞(Regulatory T cell,Treg细胞)亚群。Treg细胞和Th17细胞在自身免疫性疾病中的作用是近年来的研究热点,并提出自身免疫性疾病的Th17/Treg细胞失衡学说的免疫病理机制。IL-23在Th17细胞的诱导分化中起了很重要的强化和稳固作用,Th17细胞通过分泌包括IL-17A在内的多种细胞因子参与炎症反应,部分学者提出自身免疫性炎症的IL-23/IL-17A轴的重要作用理论。细胞因子IL-10、TGF-β既是Treg细胞的诱导分化因子,又是Treg细胞的重要效应因子,在Treg细胞介导的免疫抑制功能中发挥重要作用。视黄酸相关孤独受体?t(Retinoic acid-related orphan receptors?t, ROR?t)和叉头状蛋白—3 (Fork-head protein3, Foxp3)分别是Th17细胞和Treg细胞的特异性的核转录因子,在Th17细胞和Treg细胞的诱导分化、发挥效应中起很重要的作用。在结节病的免疫病理机制方面,近几年的研究关注Treg细胞的作用,仅有个别研究涉及结节病中的Th17细胞。本研究通过胞内细胞因子IL-17A、胞内转录因子Foxp3的染色进行Th17细胞和Treg细胞的流式细胞分析;并用ELISA法检测Th17细胞和Treg细胞的部分相关细胞因子,以及通过Real-Time PCR了解ROR?t和Foxp3的表达水平等方面探索Th17细胞、Treg细胞失衡是否参与结节病的发病以及上述细胞对糖皮质激素治疗干预的反应情况。研究方法:1.研究对象:①结节病组:10例病理确诊的初治、活动期肺结节病(Ⅰ-Ⅱ期)患者,且根据结节病治疗指南标准均需要接受治疗;糖皮质激素治疗4-6周后,根据临床表现的变化和复查的影像学资料分为激素治疗疗效好和疗效不理想两组;②健康对照组:10例年龄、性别匹配的健康志愿者;2.标本采集:①血标本:健康对照者、结节病患者治疗前及糖皮质激素治疗后4-6周,各抽取14mlEDTA抗凝静脉血,分离得单个核细(PBMC)和血浆;②BALF:治疗前结节病患者,留取BALF分离得单个核细胞和上清;3.实验方法:①流式细胞仪检测(健康对照者及结节病患者治疗前、后)PBMC和结节病治疗前BALF中单个核细胞中的CD4+IL-17A+的Th细胞(Th17细胞)比例及IL-17A的平均荧光密度值(Mean Fluorescence Index, MFI)、CD4+CD25bright+Foxp3+的T细胞(Treg细胞)的比例及Foxp3的MFI;②ELISA法检测(健康对照者血浆、结节病患者治疗前后血浆及结节病治疗前BALF的上清中)细胞因子IL23、IL-17A、IL-10和TGF-β的水平;③Real-time PCR检测结节病患者治疗前后外周血中ROR?t和Foxp3的表达水平的变化。4.统计方法:采用SAS 9.0软件包,符合正态分布的计量资料采用t检验(成组资料采用成组t检验,配对资料采用配对t检验);非正态分布的计量资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义,其中P<0.001为差异具有显著统计学意义,P>0.05为差异无统计学意义。采用GraphPad Prism4绘图。研究结果:1.入组患者情况:①平均年龄:51.9±7.6岁;女:男=9:1;②乏力8例,体重下降7例(3-15kg不等),咳嗽5例,活动后气短6例,胸痛3例,皮疹2例,低热1例;中枢性面瘫1例,所有患者均无浅表淋巴结肿大、杵状指和肺内爆裂音;③BALF的T4/T8:6.54+3.82;④Ⅰ期:Ⅱ期=4:6;糖皮质激素疗效好组5例,疗效不理想组5例;2.流式细胞检测分析Thl7细胞、Treg细胞比例及IL-17A、Foxp3的MFI:①活动期结节病治疗前外周血中的Th17细胞的比例高于健康对照者的水平(P=0.0139);活动期结节病患者治疗前BALF中的Th17细胞的比例显著高于其外周血中的水平(P值分别为P=0.0016);但上述组间的IL-17A的MFI差异无统计学意义;②活动期结节病治疗前外周血中Treg细胞的比例低于健康对照者的水平(P=0.0286),且结节病患者外周血中的Foxp3的MFI小于健康对照组的水平(P=0.0038);活动期结节病治疗前BALF中的Treg细胞的比例高于其外周血中的水平(P=0.0346),但两者Foxp3的MFI的差异无统计学意义(P>0.05);③与健康对照者外周血中的Th17细胞/Treg细胞比例的比值(Th17/Treg比值)相比,结节病患者外周血中Th17/Treg比值存在明显的失衡;④结节病患者在糖皮质激素治疗前后Th17细胞和Treg细胞比例、IL-17A和Foxp3的MFI的差异无统计学意义(P>0.05);⑤不同疗效组的结节病患者,治疗前外周血和BALF中的Th17细胞、Treg细胞的比例及IL-17A、Foxp3的MFI等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.ELISA法检测Th17细胞和Treg细胞相关细胞因子水平:①活动期结节病患者外周血中的IL-10水平高于健康对照(P=0.0406),但IL-17A、IL-10和TGF-β水平的差异无统计学意义(P>0.05);②活动期结节病患者治疗前BALF中IL-23、IL-17A水平高于外周血中的水平(P值分别为P=0.0347、P<0.0001),BALF中IL-10水平低于外周血水平(P=0.0003),而BALF和外周血中TGF-β水平的差异无统计学意义(P>0.05);③糖皮质激素治疗前、后外周血中IL-17A、IL-23、IL-10和TGF-β等细胞因子水平的差异无统计学意义(P>0.05);④不同疗效组的结节病患者,治疗前外周血和BALF中的IL-17A、IL-23、IL-10和TGF-β3等细胞因子水平差异也均无统计学意义(P>0.05)。3. Real-time PCR检测Th17细胞、Treg细胞的特异性核转录因子的表达水平:①糖皮质激素治疗前后外周血中ROR?t表达水平的差异无统计学意义(P=0.057);但从基因表达水平变化的趋势图看,治疗后ROR?t表达水平有明显的下降趋势;②糖皮质激素治疗前后外周血中Foxp3表达水平的差异有统计学意义(P=0.0135)。结论:Ⅰ-Ⅱ期初治的活动期肺结节病患者,在外周血和BALF中存在Th17/Treg细胞比值失衡及Th17细胞、Treg细胞相关细胞因子水平的紊乱,提示Th17细胞、Treg细胞可能参与肺结节病的发病。由于免疫细胞网络和细胞因子网络的复杂性,并且Th17和Treg细胞均无特异性的细胞因子,糖皮质激素治疗前后Th17、Treg细胞的比例和相关细胞因子水平无变化。但糖皮质激素治疗后能上调Foxp3的表达水平,治疗后ROR?t的表达水平差异虽无统计学意义,但也有明显的下调趋势,提示糖皮质激素可能试图通过影响Th17/Treg细胞的比值来发挥治疗作用。不过,糖皮质激素的临床疗效可能与Th17细胞、Treg细胞的表达特征及其相关细胞因子水平的差异无直接关联。