原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种以肝小叶汇管区淋巴细胞浸润、小胆管特异性破坏、血清特征性抗线粒体抗体(AMA)为特征的自身免疫性肝病,常伴有其它系统、器官的自身免疫症状,发病机理尚不明确。近年来PBC发病率不断上升,在北美国家40岁以上妇女中高达1/1000;在我国,尚没有系统性的原发性胆汁性肝硬化的流行病学数据资料,但是从文献报道和来院就医的患者数量来看,原发性胆汁性肝硬化患病率在逐年上升。目前国际上对PBC尚没有特殊有效的治疗方法,对早中期患者通常认为熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是最有效的药物。虽然熊脱氧胆酸可以明显改善胆汁淤积症状,但却不能阻断疾病进程,原发性胆汁性肝硬化发展到晚期只能通过肝移植来解决。由于原发性胆汁性肝硬化发病机理尚不完全清楚,因此,深入研究PBC发病机制和调控途径,找到其发病原因和重要调控靶点,不仅具有重要的学术价值,而且具有巨大的应用前景和社会效益。PBC是一种典型的器官特异性自身免疫性疾病,国外流行病学调查发现,PBC患者的自身抗原为位于线粒体内膜的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶复合物(2-OADC),其中以丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚基(pyruvate dehydrogenase copmlex–E2 subunit,PDC-E2)为主,大约90-95%PBC患者的血清中抗PDC-E2为阳性,PBC患者体内还可以检测到针对该抗原的细胞免疫反应异常。PBC的病因目前还不是十分清楚,遗传和环境等多种因素可能在PBC的发病中具有关键作用,分子模拟和外源化学物质可能参与PBC的发病,大肠杆菌某些组分和其他一些外源物质与自身抗原之间的分子模拟可能诱发自身免疫性疾病。越来越多的研究表明,T细胞在PBC发病中起关键性作用,但其具体调控机制还有待深入研究。最近,一类新的以分泌IL-17为主要特征而又不同于Th1和Th2的CD4+T细胞亚群Th17被发现,并被认为在机体的免疫炎症性疾病中起着重要的作用,特别是在自身免疫性疾病中起着重要的作用。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)动物模型中,发现过继输注Th17细胞比输注Th1细胞更能有效诱发EAE,注射IL-17也能加重EAE动物的症状和严重程度,而采用IL-17-/-缺陷小鼠则可以减弱疾病的进程。在一系列基因敲除小鼠中发现IL-23-/-缺陷小鼠中EAE受抑制,而IL-6-/-和TGF-βR-/-小鼠对EAE产生耐受,并且发现RORγt是Th17细胞发生过程中一个重要转录因子。本实验室前期的工作证明,PBC患者外周血中Th17细胞显著增多,单个核细胞IL-17mRNA水平和血清IL-17水平升高,提示Th17细胞在PBC的发病机制中具有重要的作用。微小RNA(microRNA,miRNA)为一类长度约为22-24个核苷酸(nt)、内源性的非编码RNA分子。它存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中,进化上高度保守。miRNA可通过调节mRNA半衰期(降解作用)或通过与3’UTR区的结合抑制靶基因翻译,从而对基因表达、细胞分化、生长发育等进行精细调控。研究显示在一些疾病中某些特定的miRNA与疾病的发生发展和预后转归密切相关。新近有研究发现细菌脂多糖(LPS)和病毒双链RNA均能诱导表达miR-155;而miR-155敲除小鼠抗感染能力低、肺组织发生疤痕样变化,与人类自身免疫病病情相似;进一步研究发现miR-155能负调控对T细胞功能特别重要的c-Maf基因。因此,某些特定的microRNA可能在T细胞功能调控中发挥重要作用,然而其具体作用机制尚待深入研究。本课题组前期经过microRNA芯片检测和聚类分析、northern blot和荧光定量PCR证实,PBC患者T细胞micro RNA谱发生显著变化。基于以上情况,我们提出了一些疑问,在变化的这些micro RNA中是否也有调控PBC自身免疫功能变化的?他们是通过何种机制影响免疫功能的?特别是是否对新发现的Th17细胞也有调控能力?调控的机制是怎样的?为了解决以上问题,我们进行了以下三部分研究:1、首先利用生物信息学手段,预测可能作用于IL-17基因并且在PBC中异常表达的micro RNA,进一步在T细胞系Jurkat细胞上验证其作用;2、诱导培养并纯化来源于PBC患者的Th17细胞;3、将候选的miRNA前体和抑制体转染入PBC患者来源Th17细胞,研究其对Th17细胞的调控作用及可能机制。第一部分利用生物信息学技术分析作于IL-17的microRNA人们在研究micro RNA与靶基因相互作用的过程中发现,micro RNA和靶基因的相互作用遵循一定的规律,这些规律可以用相应的程序及算法来实现,从而预测micro RNA和其相互作用的靶基因。由于这些软件各有利弊,也不一定完全准确,需要实验的进一步验证。因此,我们首先从多个软件中选用国内外最常用也是最权威的三个软件(miRanda,PicTar和TargetScan)进行预测,并且与课题组前期研究中发现的PBC患者T细胞中异常表达的miRNA谱进行研究比对。结果提示,在PBC患者T细胞中有四种micro RNA表达存在差异,进一步比较这四种micro RNA在人类初始CD4+T细胞、记忆性CD4+T细胞、效应性CD4+T细胞和Jurkat细胞中的表达,发现miR-26a、miR-30d在初始CD4+T细胞、记忆性CD4+T细胞、效应性CD4+T细胞表达存在差异,其中,miR-30d在Jurkat细胞中还有微弱表达。鉴于miR-26a在初始CD4+T细胞、记忆性CD4+T细胞、效应性CD4+T细胞的表达上存在差异且在Jurkat细胞上无表达,而IL 17在记忆性T细胞中表达更高,于是我们首先选取miR-26a作为我们的切入点,观察其是否真如软件中预测一样,可以调节IL 17A mRNA的表达。为了验证miR-26a对IL 17A mRNA的调控作用,我们将IL 17A基因的3’UTR和miR-26a前体共转染人类T细胞系Jurkat细胞。结果提示,转染后发现,Jurkat细胞荧光下降,证实miR-26a对IL 17A确实有调控作用。第二部分Th17细胞的刺激培养与纯化人类Th17细胞的刺激培养方案目前比较多,目前的方案主要是共刺激分子的参与和采用病变部位的淋巴细胞或分离外周血CD4+T细胞,特别是CD4+CD45RO+T细胞。我们培养来源于PBC患者的外周血单个核细胞,经过磁珠分选分选出CD4+T细胞并将贴壁细胞诱导培养出DC,经过成熟培养后经MMC处理的DC与CD4+ T细胞混合培养,加入PDC-E2163-176抗原和相关细胞因子刺激,经过捕获复合物的结合和磁珠分选,分选出IL 17+悬浮细胞,通过IL-17和RORγt的检测和流式细胞仪检测验证并测定其纯度。结果表明,纯化出来的细胞与未纯化的细胞相比,在IL 17和RORγt的表达显著增高,其纯度达到80%左右,说明Th17细胞得到了较好的分离和培养。第三部分miR 26a对PBC患者Th17细胞的调控机制研究本部分我们主要考察miR-26a对PBC患者Th17细胞的调控作用。我们将纯化的Th17细胞分别转染pre-miR 26a和anti-miR 26a,分析其细胞因子IL17分泌、细胞增殖活性和活化后诱导的细胞凋亡,分析转录因子NF-κB和AP-1的活性变化。结果表明,与正常对照相比,转染了pre-miR 26a的细胞IL-17显著下降,NF-κB和AP-1活性显著减少,细胞增殖活性下降但是没有统计学意义,活化后诱导的细胞凋亡增加;转染了anti-miR 26a的细胞IL-17 mRNA、RORγt mRNA显著上升,NF-κB和AP-1活性显著增加,细胞增殖活性上升,活化后诱导的凋亡下降。