论文部分内容阅读
JNK 是丝裂原活化激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员。对细胞的生长分化、环境应激和炎症反应等生理与病理过程均具有调控作用。Nrf2-ARE通路是抵抗内源或外源性亲电攻击,保护细胞免受氧化损伤的重要通路。NQO1作为Nrf2经典的下游靶基因,在醌类代谢,清除过氧化物,抵抗氧化损伤中起到了至关重要的作用。本文研究了 MAPK家族成员JNK介导Nrf2对下游抗氧化靶基因的转录调控作用。本文克隆出了 CpJNK和CpNQO1基因的cDNA序列全长。CpJNK的5’端非编码区的大小为240 bp,3’端非编码区的大小为2372 bp,开放阅读框为1209 bp,共编码402个氨基酸,包含一个STKc结构域(24-320aa),在该结构域中的激活环内存在JNK的保守基序T-P-Y,在Gly-225处高度保守。CpNQO1的5’UTR大小为47 bp,3’UTR大小为718 bp,ORF长度为888 bp,编码295个氨基酸,包含一个15-224aa的Flavodoxin2结构域。利用实时荧光定量PCR分析CpJNK和CpNQO1在蚌各组织的分布情况,CpJNK和CpNQO1在检测的蚌组织中均有表达,CpJNK在肝胰腺表达量最高,而CpNQO1在肾表达量最高,两者均在血细胞中表达量最低。经微囊藻毒素(MC)刺激后,肝胰腺、鳃和肾脏中CpJNK mRNA的表达整体呈现下调趋势。在褶纹冠蚌的肝胰腺中,CpJNK mRNA的表达在12和24 h极显著下调;在蚌的鳃中,CpJNK mRNA的表达在12,24和72h极显著下调;在蚌的肾中,CpJNK mRNA的表达在12和96 h极显著下调。敲降CpNrf2后,与MC组相比,蚌的肝胰腺、鳃和肾脏中CpJNK mRNA的表达呈现上调趋势。在蚌的肝胰腺中,CpJNK mRNA的表达在12和24h极显著上调;在蚌的鳃中,CpJNK mRNA的表达在72 h极显著上调。在蚌的肾中,CpJNK mRNA的表达在12和24 h极显著上调。经MC刺激后,与生理盐水(NS)组相比,CpNQO1呈上调趋势。在蚌的肝胰腺中,CpNQO1 mRNA的表达在48和72 h极显著上调。在蚌的鳃中,CpNQO1 mRNA的表达在24、48和72 h极显著上调,且在24 h表达量最高。在蚌的肾中,CpNOQ1 mRNA的表达在48和72 h极显著上调。敲降CpNrf2后,与MC组相比,肝胰腺、鳃和肾脏中CpNQO1 mRNA的表达呈现下调趋势。在蚌的肝胰腺中,CpNQO1 mRNA的表达在12、24、48和72h极显著下调。在蚌的鳃中,CpNQO1 mRNA的表达在24、72和96 h极显著下调。在蚌的肾中CpNQO1 mRNA的表达在12、24、48和96 h极显著下调。经MC刺激后,褶纹冠蚌Cu/Zn-SOD的酶活力在96h显著上调,GPx的活力在24、48h显著上调,MDA含量在72、96h显著上调。敲降Nrf2后,与MC组相比,Cu/Zn-SOD的活力在24和72h显著下调,GPx的活力在24、48、96h显著下调,MDA含量在12h显著上调。利用SP600125特异性抑制JNK后,CpNrf2的表达量较阴性对照组显著增加,且其下游靶基因CpNQO1、CpMn-SOD、CpCu/Zn-SOD、CpPRX基因的表达量在一定程度上均上调;MC刺激后,CpNrf2及其下游靶基因的表达量呈上调趋势。在加入抑制剂和MC处理后,与MC组相比,上调了 CpNrf2及其下游靶基因的表达量。Westrern-blot试验结果表明,MC处理后的P-JNK的表达量呈下调趋势,而敲降CpNrf2后,与MC组相比,P-JNK的表达量呈上调趋势;SP组CpNrf2的表达量呈上调趋势;与MC组相比,SP+MC组CpNrf2的表达量也呈上调趋势。凝胶亲和分析表明,CpNrf2能与CpNQO1启动子在体外结合。双荧光素酶报告实验表明,CpNrf2能够呈剂量依赖型上调CpNQO1的转录水平;单独的CpMafK不能调控CpNQO1的转录水平,必须与CpNrf2结合后才能发挥其转录调控作用。