研究蛋白质的魔角旋转固体NMR实验方法初探

来源 :中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所) | 被引量 : 1次 | 上传用户:liuhaichao811
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魔角旋转固体核磁共磁(NMR)在近十年得到了快速的发展,被广泛用于蛋白质研究。它能够获得具有原子分辨率的三维结构、研究蛋白质的动力学信息、以及探测蛋白质分子与其它分子之间的相互作用;它不需要将蛋白质进行结晶或者溶解。因此,魔角旋转固体NMR被认为是研究膜蛋白等不可溶蛋白质体系的非常有前景的技术。尽管固体NMR已经在膜蛋白和淀粉样蛋白纤维研究中取得了一定的进展,但其研究速度仍落后于x-射线晶体学和液体NMR方法。固体NMR研究蛋白质体系的效率受两个因素的限制:较低的灵敏度和分辨率。固体NMR研究蛋白质的低灵敏度源于低旋磁比的13C或15N的检测,而固体NMR多维相关实验的多步磁化传递过程将进一步降低获取NMR信号的效率;固体NMR的分辨率除与各向异性相互作用有关外,主要受蛋白质样品均一性的影响。因此,发展新的固体NMR方法以提高磁化传递效率、探索固体NMR优化蛋白质样品制备条件的分析策略对于蛋白质的固体NMR研究非常重要。基于此,本文主要对固体NMR多维相关实验的磁化传递步骤进行了研究,以获得更有利于蛋白质研究的新异核或同核偶极重耦方法;同时,对蛋白质样品优化的固体NMR分析过程进行了探讨,以提高样品制备条件的筛选效率、得到适用于固体NMR研究的具有高分辨率的蛋白质样品。我们先研究了多维相关实验中非常重要的’5N-13C异核偶极重耦方法。首先,通过对13C射频场使用Sine幅度调制,我们实现了双带选择性的15N13C异核磁化传递,从而可在单个实验中同时获得蛋白质主链上残基内相关和残基间相关的信息。相对于双带选择的常规方法,我们的方法具有更好的选择性和稳定性、更低的’H去耦要求,因而更有利于蛋白质信号归属的多维相关实验。接着,我们研究了相位同步反转对15N-13C CP的影响,发现非对称的相位同步反转对15N-13C异核传递的稳定性有明显的增强效果,同时可能提高15N13C异核传递的效率。非对称相位同步反转CP将有助于信号弱或长时间的多维相关实验。我们还探索了RN对称性序列在无质子去耦条件下用于频带选择性13C13C同核偶极重耦的可能性。通过大量模拟,我们获得了一些符合要求的RN对称性条件;经过进一步的实验分析,我们在标样中证实了这些RN对称性序列在无质子去耦条件下的频带选择性同核重耦效果。这些频带选择性的同核重耦方法可以提高同核磁化传递中13Cα-13Cβ传递的选择性,同时降低1H高功率去耦导致蛋白质样品发热变性的风险。为了提高蛋白质样品制备的效率,我们利用固体NMR对蛋白质样品的均一性进行了分析,并总结出适用于蛋白质样品优化的固体NMR分析策略。通过对不同的蛋白质样品进行分析,我们认为由少量的’5N标记蛋白质样品的1D’5N谱到少量的U-13C,15N标记样品的2D13C-13C/15N-13Cα相关谱的分析策略是优化蛋白质样品制备条件的有效途径。
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