副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)属于嗜盐菌,广泛存在于海水以及海产品中,在我国沿海地区,是引发食源性疾病的主要病原菌之一。副溶血弧菌的主要抗原为O抗原和K抗原,其抗原多样性常用于菌株分型研究。从全基因组水平上对副溶血弧菌进行群体遗传学研究,能够使我们更清楚地了解该物种的进化与传播关系,进一步推动相关疾病的防控和溯源工作。另外,高频同源重组是副溶血弧菌遗传进化的一个显著特点,基于全基因组序列对该物种进行种群结构和进化推动力剖析,对认清同源重组在细菌进化过程中的作用具有重要意义。本研究对采集自全球不同地区、不同分离时间的共157株副溶血弧菌进行了全基因组测序,并对其基因组多态性进行了深入分析,目的在于加深以下三个方面的认识:①副溶血弧菌整个种群的遗传多样性基本特征;②副溶血弧菌流行性克隆群的进化以及全局种群结构;③估算种群有效种群大小(effective population size,Ne)并探索种群的进化推动力。副溶血弧菌的全基因组变异检测根据基因组序列在群体中的存在情况不同,可以将基因组序列划分为核心基因组(core-genome)和泛基因组(pan-genome)。本研究中鉴定区分了157株副溶血弧菌的核心基因组和泛基因组,鉴定出核心基因组大小为4.07Mbp,泛基因组为17.33Mbp。SNP指的是基因组水平上的单个核苷酸发生变异引起的DNA序列多态性。本研究基于全基因组的测序数据,使用包括MUMmer、SOAP在内的多种生物信息学软件,检测到存在于157株菌核心基因组上的共327,904个高质量双等位SNP。为后续系统发育结构重建以及种群遗传学参数的定量化计算提供了基础数据。副溶血弧菌流行性克隆群的鉴定和系统发育分析系统发育结构能够直观地表征出物种或群体的进化路径和先后关系。本研究基于三十余万个SNP位点的变异信息,使用邻接算法构建了157株副溶血弧菌的系统发育结构,得到了157株菌的系统发生树。结果发现:由于副溶血弧菌群体中重组频率高,掩盖了竖向遗传信号,使得系统发生树中内部节点的可靠性低、分支短,整体呈现辐射状。虽然从构建的系统发生树中并不能清楚地得到群体中菌株进化的先后顺序,本研究仍然在这些样品中鉴定出21个克隆群:共包含107株菌,其平均遗传距离为281个SNP,远小于种群平均遗传距离35,500个SNP。克隆群内部菌株分化时间相对较短,重组事件的数目相应较少,因此可以根据SNP在基因组上的分布聚集情况被鉴定出来。本研究使用PAML软件包和Rec HMM软件分别推算了21个克隆群菌株种群内部的重组事件,给出了克隆群菌株中重组片段的大小和位置并在流行性克隆群菌株的分析中,发现了一个覆盖O抗原和K抗原编码基因的重组热点,长度158.5 kb。排除这些重组造成的影响后,本研究重建了流行性克隆群菌株的系统发育结构,在地理分布上,除一个子群中所有菌株分离自台湾地区外,其他子群的菌株均分离自世界不同地区,表明该群菌株在全球范围发生着迅速的扩散。全局种群结构及海洋性基因库连锁失衡(linkage disequilibrium,LD)可以反映重组的程度,为量化比较副溶血弧菌种群重组大小,本研究中使用了Haploview软件计算并比较了副溶血弧菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌以及霍乱弧菌的连锁失衡水平,比较发现VP菌株在250 bp的时候其连锁失衡的值便降到了初始值的一半,在对照物种中,只有幽门螺杆菌和大肠杆菌的下降速度比VP快,另外,副溶血弧菌群体中相距较远的SNP的LD值比其他物种都低,其LD的观测值与完全混合种群的理论预测值相当。为探讨整个物种的种群结构特征以及基因流向,本研究构建了由71株菌组成的非冗余基因组集,包括50株非克隆群菌株以及每个克隆群中各挑选的一株代表性菌株。应用种群结构分析软件Chromo Painter和fine STRUCTURE对非冗余基因组集进行解析,发现副溶血弧菌由11个种群(Population)组成;其中包括8个主要由亚洲菌株组成的亚洲群(Asia-pop)、1个北美菌株占主体的美洲群(US-pop)和两个介于亚洲群和美洲群之间的混杂群(Hyb-pop)。其中,8个亚洲群共包含51株菌;美洲群和两个混杂群分别包含3株、两株和5株菌。亚洲群和美洲群的菌株的Fst值为0.071,其他各种群间的Fst也较低,说明所估计的亚洲群的核酸多样性与整个种群的估计值是相近的;迁徙速率计算结果说明种群中所发生的迁徙事件很少。因此,亚洲群和美洲群菌株可能是由于地理隔离的原因,各自分享其独特的基因库。本研究分离自美洲的菌株较少。为进一步确认基因库存在的可靠性,使用structure软件对pub MLST数据库中648株副溶血弧菌、7个看家基因的核酸序列进行分析;综合Chromo Painter的分析结果,发现与美洲群菌株有着高共祖率的ST型绝大部分来自墨西哥湾地区,另一方面,分离自墨西哥湾的大部分ST型都与美洲群菌株相关。考虑到副溶血弧菌是一种海洋性细菌,结合其种群的地理分布可以确定,该物种至少存在两个海洋性基因库——亚洲环太平洋沿岸基因库和北美墨西哥湾基因库。副溶血弧菌的进化推动力分析本研究分析表明,亚洲群的51株副溶血弧菌菌株代表的是一个自由混合的群体,因此可以使用群体遗传学的方法来估算参数Ner(其中Ne代表有效种群大小,r代表某一位点每一代发生重组的概率),进而分析其进化推动力。本研究中使用了两种不同的方法来估计Ner的值,其中基于基因组上单个变异位点估计的Ner为9.8;基于整个有机体水平的Ner的估计值为268。中性进化条件下,两种方法得到的Ner应该一致,但实际结果是两者相差27倍,这可能是由于该物种中存在有机体水平的选择效应,种群中稳定保持着多种生态型,使得不同生态型间的菌株溯祖可能性降低,但是不一定会影响到那些非生态型选择区域的变化。生态型模型预测了基因组中存在上位相互作用位点,因此可以通过鉴定上位相互作用的存在与否来验证生态型模型的假设。通过370亿次的fisher精确检验,对基因组上所有SNP在菌株中的分布进行了两两间的检测,并使用Q-Q图对结果进行了可视化,最终发现一组在基因组上相距400 kbp的SNP有显著关联关系(p<10-9),即存在上位相互作用。通过SNP与基因组片段之间的分析,同样检测到上位相互作用位点的存在。本研究中发现的上位相互作用位点主要涉及VI型分泌系统(T6SS)、受环鸟苷酸二聚体(c-di-GMP)调控的生物膜形成相关基因。在副溶血弧菌基因组中,这两套系统的编码基因不能共存,由此可见,这些上位相互作用位点受到强烈的自然选择作用,与副溶血弧菌在不同生境中的适应性密切相关。