肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的一种形式，由于对传统的化疗药物存在抗性，而且肝脏对放疗缺乏耐受性，因此目前肝癌的临床治疗效果不容乐观，预后差、易复发，急待发展新的更有效的治疗策略，而基因治疗正成为人们努力的方向。肝癌的基因治疗，首先要解决的重要问题是如何将治疗基因靶向性地在体内导入靶细胞，并可在靶细胞特异性表达，以及选择最有效的治疗基因。精确的靶向性治疗能降低毒性，提高治疗指数。在转录水平调控转基因表达是实现靶向性的更为精确和有效的方法。因此，寻找具有组织特异性或肿瘤特异性的顺式作用元件十分必要。流行病学研究表明，HBV感染与肝细胞癌的高发性密切相关。HBV是嗜肝病毒，实验证明HBV基因组的两个区域具有转录增强子活性，并且具有明显的肝特异性以及协同作用。因此联合应用HBV基因组中增强子和启动子元件可以实现外源基因肝特异性表达。鉴于此，我们自行克隆并构建了包括HBV增强子1、增强子2及核心启动子序列在内的一个杂合的突变型HBV启动子，转录活性分析表明与强启动子SV40比较，该启动子在肝癌细胞株中具有较高的转录活性，尤其在整合有HBV基因组的肝癌细胞株2.2.15中，其转录活性更高。因此，该突变型HBV启动子可以用于肝癌，尤其是整合有HBV基因组的肝癌的靶向性基因治疗。特异性杀伤肿瘤细胞是成功的肿瘤治疗所必需的，因此来自鸡贫血病毒的凋亡蛋白——Apoptin成为治疗基因的首选。大量的体外研究表明Apoptin能特异性诱导恶性和转化细胞凋亡，但不诱导正常细胞凋亡；Apoptin诱导凋亡不依赖p53途径，不被Bcl-2抑制，而这两种因素是肿瘤对传统化疗和放疗产生抗性的主要原因。尽管目前对Apoptin能区分肿瘤和正常细胞的特异性杀伤机制尚未完全阐明，但这并不影响Apoptin在基因治疗中的应用。因此，我们设想如果联合应用突变型HBV启动子的肝特异转录活性与Apoptin的肿瘤特异杀伤作用，那么这种具有双重特异性的载体系统用于肝癌基因治疗，将会提高对肝癌细胞的特异性杀伤，同时减少对正常肝组织以及非肝组织的损伤，从而降低毒副作用，提高治疗指数。在本研究中，我们首先构建了突变型HBV启动子调控apoptin表达的质粒和腺病毒载体，并进行了体外抑癌作用研究。结果表明，质粒载体能够抑制肝癌细胞株HepG2增殖及诱导其凋亡，但对2.2.15细胞作用不显著，尽管Apoptin在2.2.15细胞中的mRNA表达水平显著高于在HepG2细胞中的表达。当换用腺病毒载体后，Apoptin对HepG2细胞和2.2.15细胞的作用均显著增强，尤其是能够诱导2.2.15细胞产生凋亡，尽管作用效果仍弱于对HepG2细胞的作用。这些结果提示利用突变型HBV启动子调控apoptin表达的腺病毒载体进行肝癌的靶向性基因治疗是可行的。为了阐明Apoptin在2.2.15细胞和HepG2细胞中诱导凋亡活性存在差异的原因，我们从Apoptin作用机制方面进行了探讨。首先，我们检测了Apoptin在2.2.15细胞和HepG2细胞中亚细胞定位情况，结果表明Apoptin在两种细胞中的亚细胞定位存在差异：Apoptin在HepG2细胞中多定位于细胞核，而在2.2.15细胞中则多定位于细胞质。由于Apoptin在肿瘤细胞中的细胞核定位是其诱导凋亡所必需的，因此Apoptin在两种细胞中的亚细胞定位结果支持了Apoptin对它们诱导凋亡能力不同的现象。其次，由于Apoptin是通过细胞凋亡因子发挥作用，caspase-3的活化对其快速诱导凋亡十分必要，因此我们检测了病毒介导和质粒介导apoptin基因进入2.2.15细胞后，caspase-3活性改变情况。结果表明当apoptin进入2.2.15细胞后，caspase-3活性增加，提示Apoptin在2.2.15细胞中的作用涉及caspase-3的活化。但是体外抑癌作用研究结果显示Apoptin在2.2.15细胞中的作用相对较低，这可能是由于Apoptin诱导肿瘤凋亡还涉及caspase-3下游重要凋亡执行因子，而这些重要凋亡执行因子恰恰在2.2.15细胞中表达减少或缺失。在caspase-3活性分析中，我们还发现当用化疗药物顺铂分别处理2.2.15细胞和HepG2细胞后，前者中caspase-3活性的增加比后者更明显。通过检测caspase-3前体在两种细胞中蛋白表达情况，发现caspase-3前体在2.2.15细胞中的表达显著高于在HepG2细胞中的表达，这可能就是顺铂处理后2.2.15细胞中caspase-3活性更强的原因。这些结果也提示设法激活凋亡诱导中下游执行caspase—caspase-3，或发现caspase-3的重要下游底物，通过与Apoptin联合应用，可能会进一步提高Apoptin对2.2.15细胞的抑制作用。由于2.2.15细胞是整合有HBV基因组的HepG2细胞，HBV基因组的存在可能导致了Apoptin在两种细胞中作用效果的差异。我们用抗病毒药物拉米夫定处理2.2.15细胞后再导入apoptin基因，凋亡检测结果表明拉米夫定处理后的2.2.15细胞对apoptin的敏感性增强，这为apoptin基因治疗与抗HBV治疗联合应用提供了实验依据。HBV对宿主细胞的影响是一个长期而复杂的过程，为了更全面了解2.2.15细胞中影响Apoptin生物学作用的因素，我们又针对2.2.15细胞和HepG2细胞进行了基因芯片检测。结果显示两种细胞之间存在大量表达差异基因，包括许多具有重要功能的细胞骨架蛋白基因及凋亡相关基因。芯片结果进一步提示广泛的基因表达差异可能导致了Apoptin对两种细胞不同的凋亡诱导能力。这些资料也将对HBV致癌机理的研究提供参考。总之，在本研究中我们联合应用突变型HBV启动子的肝特异转录活性与Apoptin的肿瘤特异杀伤作用，成功构建了突变型HBV启动子调控apoptin表达的质粒和腺病毒载体，并进行了体外抑癌作用研究。初步研究结果表明突变型HBV启动子调控apoptin表达的腺病毒载体可以诱导肝癌细胞株HepG2和整合有HBV基因组的肝癌细胞株2.2.15产生凋亡，具有用于肝癌基因治疗的可行性。其次，我们首次发现Apoptin在肝癌细胞中的肿瘤特异性杀伤活性受到HBV感染的影响，抗HBV药物与apoptin基因治疗联合应用，将进一步提高Apoptin对2.2.15细胞的杀伤作用。此外，决定Apoptin在肿瘤细胞中细胞核定位的因素以及caspasc-3重要下游执行底物的改变可能导致了Apoptin对HepG2细胞和2.2.15细胞体外抑制作用的差异，基因芯片结果为我们下一步深入研究提供了线索。