背景和目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是常见的内分泌代谢系统疾病,是由于胰岛素不足或胰岛素的细胞代谢作用缺陷所引起的葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的一种综合症。平均每年全球死于糖尿病的人数已经超过290万,占总死亡率的5.2%。中国每年新增加的糖尿病患者约为120.5万,每天约有3000个初发糖尿病患者。而糖尿病的并发症是引起糖尿病患者致死、致残的主要原因。因此,糖尿病的各种并发症的有效防治是提高糖尿病患者生活质量及延长糖尿病患者生命的重要手段。在各种糖尿病诱发的并发症中,皮肤病的发病率非常高。在进行皮肤疾病的对症治疗中,经常需要外用皮质激素来配合治疗。皮质激素是临床上应用最广泛的一类激素,如抗生素一样,皮质激素的滥用已经受到全社会的广泛关注。由于皮质激素类药物本身可以引起血糖升高,且对于糖尿病患者而言,皮质激素药物的不恰当使用,将加重各种并发症严重程度,或增加药物的毒副作用,或降低药物的治疗效果,从而极大地降低患者的预期寿命。因而糖尿病患者应该忌用皮质激素。然而,糖尿病患者应用皮质激素的比例仍然很高,特别是皮质激素的外用问题,这是因为在各种糖尿病诱发的并发症中,皮肤病的发病率非常高。资料显示,糖尿病患者罹患皮肤病的比例约占25%～30%。糖尿病诱发的皮肤病包括：黑棘皮症,类脂性渐进性坏死,硬化病,环形肉芽肿,红癣,坏死性筋膜炎,毛霉菌病等,在进行皮肤疾病的对症治疗中,经常需要外用皮质激素来配合治疗,以便缓解症状。因此,迫切需要回答这样的问题,糖尿病患者应该如何合理地外用皮质激素?再者,我们发现,如果仅考虑微循环代谢障碍及其对皮肤胶原蛋白的影响,几乎所有糖尿病患者均有皮肤受损。那么,皮质激素经糖尿病患者已经受损皮肤的渗透和吸收的机制与正常皮肤相比会产生什么样的差异?这些问题是药师义不容辞需要回答的问题。遗憾的是：目前,尚无国内外研究者来探索研究这个问题,故没有可以参考的文献资料。地塞米松是一种非常常用的皮质激素,其有两种重要的衍生物可作为透皮制剂,即脂溶性的醋酸地塞米松(DA)和水溶性的地塞米松磷酸钠(DSP),那么由于糖尿病引起形态改变的皮肤,局部外用该两种地塞米松酯类后,是否会与正常人使用时引起同样的结果。特别是糖尿病是一种长期的慢性疾病,在对症治疗其诱发的皮肤病过程中,需要长期局部使用皮质激素,但如何合理地使用,同非糖尿病患者的使用相比需要引起哪些注意呢?本文的目的即为回答这个问题提供一些实验依据。微透析(Microdialysis)技术是一种先进的在体取样技术,其最大优点是可在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体,实时和在线取样,该技术用来监测生物体局部药物浓度有着独特的优势。为此,本项目采用成熟的Franz渗透技术以及正在发展的微透析技术,目的在于比较分析脂溶性皮质激素DA和水溶性DSP经模型糖尿病大鼠皮肤和正常大鼠皮肤的渗透和吸收差异,评价糖尿病前后对不同脂溶性皮质激素经皮转运规律。在糖尿病研究领域,这是首次回答问题：糖尿病患者怎样合理使用糖皮质激素,在使用过程中的注意事项是什么。希望研究结果能为临床药师开展针对糖尿病病人合理外用DA及DSP外用制剂咨询提供依据,为指导临床医师、护士防治及护理糖尿病患者时适宜地外用DA及DSP制剂提供一定的实验参考依据。此外,为了探讨DA和DSP的油水分配系数与其体外经皮渗透速率之间的相关性,本课题还考察了两种药物在不同pH磷酸缓冲液中的油水分配系数,并研究了其在不同pH磷酸缓冲液的体外透过情况,期望通过探讨两种药物在不同PH介质中油水分配系数与体外经皮渗透速率的变化规律,为更科学地进行地塞米松经皮给药制剂的设计和临床更合理地使用提供实验依据。内容和结果为测定不同样本中醋酸地塞米松及地塞米松磷酸钠的浓度,本课题首先建立了稳定可靠的醋酸地塞米松HPLC及LC-MS/MS检测方法；地塞米松磷酸钠HPLC检测方法。其中DA的HPLC条件为：Waters C18反向柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相：甲醇一水(65：35),检测波长：243nm,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,进样量：20μL。DSP的液相条件为：Waters C18反向柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相：甲醇—0.34%磷酸二氢钾(用磷酸调至PH=3.00)(60：40),检测波长：245nm,流速:1.0mL·min-1,柱温30℃,进样量：20μL。DA的液质条件：Agilent C18反向柱(4.6mm×50mm,1.8μm),流动相：甲醇—0.1%甲酸溶液：80-20,流速为0.4ml/min,柱温为25℃,进样量10μl；离子源：ESI+,电离电压：+4.0kV,离子源温度：110℃,干燥气温度：350℃,流量：7 L·min-1,监测模式为：MRM模式,DA检测离子m/z 435→415,碰撞解离诱导电压值：110V；碰撞能量：5eV。本课题使用的是实验室自制的醋酸地塞米松和地塞米松磷酸钠乳膏,一种常用的经皮剂型,空白基质材料及制备方法的选择均来自于《新编医院制剂技术》中的规定,乳膏的质量检查方法来源于中国药典,检查结果表明自制的乳膏的药物含量(醋酸地塞米松2.0600%,地塞米松磷酸钠2.0633%)符合中国药典的相关规定。为了比较药物经正常皮肤及糖尿病皮肤的渗透和吸收结果,需要建立一种糖尿病模型。本课题选择大鼠作为实验对象,且在众多建立糖尿病模型的方法中,选择了单次腹腔注射STZ(55mg·kg-1)的方法来建立糖尿病模型。此方法不仅操作简单,且成功率高。造模好的大鼠饲养30天后再进行后续实验。在此期间,用血糖仪测尾尖血糖,以血糖>14mmol/L作为糖尿病成型标准,并把血糖小于14mmol/L的大鼠排除于实验之外。为了观察糖尿病皮肤的改变情况,我们还将正常大鼠和造模30天后的糖尿病大鼠腹部皮肤取下制作成病理切片,并进行HE染色后观察是否存在组织学差异。结果表明,正常组大鼠的腹部皮肤表现为正常的皮肤形态,而与正常组皮肤相比,造模一个月后的糖尿病组大鼠表皮组织变薄,表皮细胞层次欠清晰,部分表皮缺乏复层排列,皮下脂肪进行性萎缩或消失。为了考察糖尿病大鼠皮肤的改变对不同脂溶性地塞米松经皮渗透与吸收的影响,我们分别用改良型Franz扩散池和微透析进行了体外透皮扩散和体内经皮渗透吸收实验。体外透皮扩散实验中,取正常及成功造模30天后的糖尿病大鼠腹部去毛的皮肤置于改良型Franz扩散池中进行实验,分别给予DA乳膏和DSP乳膏后,采用20%乙醇生理盐水溶液作为接受液,最后用HPLC法直接测定接收液中药物的含量,并计算出药物的渗透速率。经皮渗透实验结束后取下扩散池中的鼠皮,提取出皮肤中蓄积的药物用HPLC法测定皮肤中药物的含量。结果显示,DA乳膏的正常组及糖尿病组的渗透速率分别为0.7947±0.3630(n=20)和0.7801±0.4480 (n=20) (μg·h-1·cm-2),两组之间无显著差异(t=0.113,P=0.911),且两组中DA 24h后在完整皮肤中的残留量无显著差异(t=0.062,P=0.951)分别为3.20±0.12和3.28±3.09；DSP乳膏的正常组及糖尿病组的渗透速率分别为42.6156±10.6145(n=20)和68.3435±15.1866 (n=20) (μg·h-1·cm-2),两组之间存在显著差异(t=-6.210,P<0.001),且两组中DSP 24h后在完整皮肤中的残留量也存在显著差异(t=-6.391,P<0.001),分别为43.81±32.04和80.17±53.81μg/g,糖尿病组显著高于正常组。在体内经皮渗透吸收实验中,大鼠麻醉后在其右侧颈静脉中及腹部皮下埋入探针,以空白生理盐水做灌流液,灌流速度为0.5μl/mL,平衡120min后腹部植入探针上方给予DA或DSP乳膏并收集透过液,每60min收集一管,共收集12h。得到的透析液用LC-MS法(DA)或HPLC法(DSP)直接测定药物的浓度。得到药物浓度后采用Phoenix WinNonlin 2.0软件计算出DA和DSP分别在正常组和糖尿病组大鼠腹部皮下的药动学参数AUCall(药时曲线下面积)、Cmax(药物峰浓度)和tmax(药物达峰时间)。结果表明,正常组和糖尿病组中DA在皮下的所有药动学参数均无显著差异；而对于DSP,糖尿病组中大鼠皮下DSP的药动学参数AUCall(药时曲线下面积)和Cmax(药物峰浓度)则显著高于正常组,但两组中DSP的tmax(药物达峰时间)一致。这说明糖尿病皮肤的改变显著增加了DSP的局部渗透吸收但对DA的局部渗透与吸收无显著影响。本课题还探讨了脂溶性DA和水溶性DSP在不同pH值条件下的油水分配系数与其体外经皮渗透速率之间的相关性。研究中采用了高效液相含量测定法测定醋酸地塞米松和地塞米松磷酸钠在不同pH环境中的油水分配系数,并采用改良型Franz扩散池装置通过体外透皮扩散实验得到两种药物在不同pH环境中的经皮渗透速率,再分别对药物的上述两种参数进行相关性考察。实验结果表明,在本实验研究的脂溶性及pH范围内,醋酸地塞米松的体外经皮渗透速率与油水分配系数的回归方程为Y=4.682-0.03X, r2=0.906 (P=0.013),具有良好的负相关性；地塞米松磷酸钠的体外经皮渗透速率与油水分配系数的回归方程为Y=7.923+3.393X, r2=0.939(P=0.006),具有良好的正相关性。结论与讨论本研究中建立了成熟的糖尿病大鼠造模方法,及DA的HPLC、LC-MS/MS检测方法,DSP的HPLC检测方法,并完善了微透析的实验方法。病理切片的结果中显示了糖尿病后大鼠皮肤组织的改变,提示糖尿病患者的皮肤很可能也发生了类似的病理改变。体外透皮扩散实验及体内经皮渗透实验结果均表明,糖尿病大鼠皮肤的病理改变能显著提高DSP的经皮吸收与渗透却对DA的经皮渗透与吸收无影响。从前人的研究结果得知,完整的皮肤是由角质层、表皮、真皮和皮下脂肪组成的,绝大多数药物经皮吸收的主要途径是先通过角质层细胞膜,再通过表皮达到皮肤其他各层。于是我们猜想,根据上述糖尿病皮肤的特殊病理改变(表皮组织变薄,表皮细胞层次欠清晰,部分表皮缺乏复层排列,复层排列基本消失,皮下脂肪进行性萎缩或消失),理论上绝大多数药物经过糖尿病患者的皮肤的渗透量应该都应该增加,但是我们得到的结果是：DA经正常皮肤或糖尿病皮肤的渗透量没有显著差异,而DSP经糖尿病皮肤的渗透量要显著大于其经正常皮肤的渗透量。众所周知,药物的溶解性与油/水分配系数直接影响到药物的经皮吸收。一般而言,药物穿透皮肤的能力是：油溶性药物>水溶性药物。但实际上,既能油溶又能水溶的药物(即K值适中者)具有较高的穿透性,吸收最好的药物是在油溶液中与在水溶液中的溶解度相同,油溶性很大的药物可能会聚集、滞留在角质层而难被进一步吸收。经分析我们认为出现以上结果的原因之一可能是因为与DA、DSP溶解性和油/水分配系数有关,故在得到两种药物的经皮吸收行为的相关数据后本文又测定了两种药物的油水分配系数,发现DA的油水分配系数为391.44±61.38(n=5), DSP的油水分配系数为0.76±0.19(n=5)。DA的油溶性极大,可能会聚集、滞留在角质层而难被进一步吸收,故糖尿病皮肤的改变无法提高其经皮渗透与吸收的量。另外我们知道,经皮吸收制剂中的药物向皮下的转移应该主要经过以下两个过程：1、基质中的药物经扩散作用到达皮肤表面；2、到达皮肤表面的药物从皮肤表面渗透进入皮下。故我们猜测还有一个因素可能造成上述现象,即DA的限速步骤是它从基质中扩散到达皮肤表面,而不是从皮肤表面渗透进入皮下,而DSP则相反,限速步骤是它从皮肤表面渗透进入皮下,而不是从系统中释放进入到皮肤表面。所以糖尿病皮肤角质层和表皮层的病理改变才会只对DSP的渗透过程有显著影响。由此,我们推断,糖尿病患者在使用DA及DSP时,很可能也会产生类似的情况因此,提示糖尿病患者在使用DA及DSP等外用皮质激素类药物时,可能需要酌情考虑药物的使用剂量。另外,通过对脂溶性醋酸地塞米松和水溶性地塞米松磷酸钠的油水分配系数与其体外经皮渗透速率之间的相关性的探讨,可得到结论,随着pH值的增加,醋酸地塞米松的油水分配系数有不断增加的趋势,其体外经皮渗透速率则成不断下降的趋势；而地塞米松磷酸钠的油水分配系数及其体外经皮渗透速率则随着pH值的增加而均不断减小。因此,两种不同脂溶性的地塞米松外用制剂的pH值或油水分配系数的增大(或减少)可能会对该两种药物的体外经皮渗透速率产生性质不同(增大或减少)的影响,从而对此两种药物经皮给药疗效的发挥也可能具有性质不同的影响作用。在课题研究中,由于时间、精力等原因,还有很多不足之处。例如,只有DA和DSP两种药物的研究数据并不能直接说明糖尿病皮肤改变后对药物的透过增加是否与药物的油水分配系数和渗透的限速步骤有关,这需要增加相关典型药物的实验；体内实验中,由于血浆中药物浓度低及血浆中复杂的酶代谢系统等原因未测得血浆中药物的浓度,还有待进一步研究；微透析实验的回收率的计算方法还有待进一步完善,等等。希望这些能够在以后的研究加以完善补充。