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目的探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠骨骼肌成肌调节因子(MyoD)基因表达的影响。方法选择健康的雄性SD大鼠72只,体重195±5g,随机分成3组,即A组:空白对照组、B组:去神经组、C组:去神经MG-132干预组,每组24只。A组不做处理;B组和C组全部制作成标准的右侧坐骨神经离断,腓肠肌失神经支配模型,并在C组大鼠失神经腓肠肌局部多点注射浓度为20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG-132 100μL,1次/d。分别于去神经第2d、7d、14d、28d,用脊椎脱臼法处死大鼠,解剖并分离出右小腿的腓肠肌,切取的肌肉样本快速置于-70℃冰箱冻存,留待28天后统一检测。用逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)检测MyoD mRNA的表达变化,以GAPDH作为内参照,做半定量检测。取样本组织50mg匀浆后用抽提试剂进行总RNA抽提,然后用MBI公司的RT-PCR试剂盒,按样本RNA2μg,20μl体系进行反转录。MyoD的引物通过primer5.0引物设计软件设计,片断长度为137bp;作为内参照的GAPDH的引物由山西医科大学实验中心提供,片断长度为307bp。聚合酶链反应按50μl体系,反应条件为: 94℃,2′,1cycle。94℃,30″;Tm(MyoD 53℃)/(GAPDH 50℃),30″;72℃,2′,36 cycle。用琼脂糖凝胶水平电泳,电压采用160v,电泳约1h,然后用凝胶成像仪获取图像。用免疫印迹法(Westernblot法)测定MyoD的蛋白质表达的变化:用β-actin作为内参照,做半定量检测。取样本组织100mg匀浆后用普利莱蛋白提取试剂盒进行总蛋白抽提,煮沸、离心后,加样于垂直电泳槽行SDS-PAGE,电泳约3小时,转膜1小时30分钟,封闭室温4小时,孵育一抗(Ab1)4℃过夜,漂洗后孵育二抗(Ab2)4℃约4小时,TBS漂洗后,置于暗室加ECL发光试剂盒反应,一分钟左右立即放在暗箱曝光,60秒左右取出浸入显影剂内,观察至最佳显影后,捞出在清水中洗净,然后置于定影剂中15分钟,取出晾干后用数码相机获取图片。最后用Photoshop图像软件获取数据,用Spss13.0软件进行统计分析。结果(1)B组和C组MyoD的mRNA和蛋白含量在去神经支配后第2d、7d、14d、28d均表达上调与A组比较有统计学差异(P<0.05);(2)B组与C组的MyoDmRNA和蛋白含量在去神经支配后第2d、7d、14d、28d的比较有统计学差异(P<0.05);(3)大鼠骨骼肌失神经支配早期,失神经的时间和失神经后的干预因素相互作用,影响去神经骨骼肌Myod mRNA和蛋白含量的表达。结论(1)在SD大鼠腓肠肌去神经早期,Myod mRNA和蛋白质的表达是上调的;(2)在失神经骨骼肌中,Myod mRNA和蛋白质的表达受到时间和干预方法二因素的交互影响;(3)蛋白酶体抑制剂MG-132可以通过抑制泛素-蛋白酶体途径,上调MyoD因子的表达,进一步影响肌萎缩后的肌再生过程,这可能也是其延缓骨骼肌萎缩的作用机理之一。