二羧酸类化学品,作为一类重要的大宗化学品,被广泛用于食品、医药、材料、纺织等领域;特别是作为尼龙单体用于聚合形成聚酰胺工程塑料或合成纤维,具有庞大的商业市场前景,应用价值巨大。至今,传统C5及更长碳链的二羧酸类尼龙单体的生产主要依赖于石油资源。但是,随着化石资源的逐渐枯竭以及环境污染问题的日益突出,生物基化学品的合成越来越受到人们的重视,比如,己二酸和戊二酸的生物基合成研究正逐渐兴起。随着合成生物学技术的发展,通过途径设计、元件及模块组装进行化学品从头生物合成的理念及技术越来越受到人们青睐。众所周知,大肠杆菌由于其遗传背景清楚、遗传操作平台成熟、生长快速等特点成为理想的异源生物合成的底盘细胞。因此本学位论文以大肠杆菌为底盘,进行二羧酸类典型化学品一己二酸及戊二酸的从头生物合成途径的设计与验证。首先,本研究设计了一条基于逆向β-氧化途径的二羧酸从头生物合成途径。该途径始于乙酰辅酶A与琥珀酰辅酶A缩合,再经过后续还原、脱水、加氢、去除辅酶A的步骤合成己二酸。本研究通过体外多酶促反应验证了所募集催化元件的功能,并将该途径中所有基因导入大肠杆菌中,首次成功获得了利用葡萄糖直接产己二酸的重组菌株。接着,通过对宿主细胞进行代谢工程改造增强前体供给,并将原有途径中的3-羰基己二酸单酰辅酶A还原酶以及3-羟基己二酸单酰辅酶A脱水酶替换成更高效的催化元件,提高了己二酸在重组菌株中的生产水平。最后,针对己二酸的生物合成途径中的两步反应存在热力学平衡趋向于分解反应的问题,对途径进行了再设计,使之在热力学上更可行。本研究将己二酸的产量在初始工程菌株的基础上提高了近20倍,但是,其发酵产量还很低、小于1mg/L,主要原因可能是目前所采用的催化元件对于相应的底物不是最适导致其催化效率不足。如何挖掘更高效的催化元件,以及提高这些元件与宿主的匹配性,可能是进一步提升生物合成效率的关键。在已报导的戊烯二酸生物合成途径的基础上,本研究又设计了一种基于α-酮酸还原途径的二羧酸生物合成途径。该途径始于α-酮戊二酸还原,通过辅酶A活化、脱水反应形成中间体2,3-烯戊二酸单酰辅酶A。接着,通过引入上述逆向β-氧化途径中所验证的反式烯酰辅酶A还原酶Ter以及硫酯酶TesB,填补了 2,3-烯戊二酸单酰辅酶A向戊二酸转化的途径空缺,由此获得重组菌株成功获得从头合成戊二酸的能力,从而验证了α-酮酸还原途径生物生成饱和二羧酸的可行性。为了提高该途径下游步骤的转化效率,通过对来源于齿垢密螺旋体的反式烯酰辅酶A还原酶tdTer的底物通道附近氨基酸残基进行改造,提高了戊二酸的生产水平50%,至6.0 ±0.5 mg/L。利用α-酮酸还原途径合成饱和二羧酸化学品的研究,在我们发表之前未见其他报道。在利用上述α-酮酸还原途径产戊二酸的过程中,由于合成途径关键酶2-羟基戊二酸单酰辅酶A脱水酶(HgdABC)是一种Fe-S簇氧敏感蛋白,因此重组菌株必须在绝对厌氧条件下产戊二酸。然而,相比于好氧条件,厌氧发酵对于细胞量积累以及代谢活力明显不足。因此,本研究采取了一种好氧-厌氧切换两阶段培养的方式,使重组菌株在在好氧培养的条件下先快速积累生物量,之后通过切换至厌氧培养,在保证HgdABC活力的情况下来合成戊二酸。该策略使得戊二酸的产量进一步提高了约30%。接着,通过引入基因开关,将编码氧敏感的酶HgdABC的基因置于厌氧诱导启动子Pnαr下,使该基因仅在培养条件切换后激活表达,让表达与发酵策略更匹配,进而提高它的表达效率。在细胞对数生长前期(5 h)进行好氧-厌氧切换,并结合启动子的替换,这种遗传及发酵手段的结合使得戊二酸的最终产量相较于原来的持续厌氧培养提升了近100%,达到11.6 ± 0.5 mg/L,同时也使该途径另外两种二羧酸产物戊烯二酸以及2-羟基戊二酸的产量分别提高了近5倍和3倍,为108.8 mg/L及0.4 g/L,证明该策略提升了基于α-酮酸还原途径生产二羧酸化学品的效率。综上,本学位论文主要围绕二羧酸类化学品的从头生物合成,设计并验证了基于逆向β-氧化以及α-酮酸还原两种途径,成功使合成生物学改造之后的大肠杆菌具备了合成二羧酸类化学品的能力,并分别在途径设计、催化元件、底盘宿主、发酵过程等相关层面进行了考察,获得了诸多信息。该工作不仅为生物基二羧酸类化学品的生产提供了可能的方法,也为基于这两种途径设计合成并优化其它非天然化学品的生产提供良好借鉴。