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奶牛乳腺炎作为影响奶牛业发展的主要疾病之一,不仅损害了奶牛的健康,而且导致了乳制品质量的降低,其中病原微生物是诱导乳腺炎产生的首要因素,许多病原微生物能够诱导细胞凋亡,并以此影响疾病的发生及发展过程。为了研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial Cells,BMECs)对主要炎性因子表达和细胞凋亡的影响,本实验通过改进联合酶消化组织块法成功体外培养了BMECs并进行免疫细胞化学鉴定。选取纯化后第5代BMECs,分别加入不同浓度的S.aureus、E.coli,经公式计算感染量为0.6 mL得出最佳感染浓度。再分别加入活菌比(MOI)为100:1最佳浓度的S.aureus、E.coli对细胞进行感染,在感染后第0、3、6、9、12小时取样。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测对IL-1β、IL1RⅠ及TNF-α的表达,利用Tunel(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,Tunel)检测不同浓度S.aureus或E.coli感染细胞凋亡情况。研究结果显示:(1)成功在体外培养了奶牛乳腺上皮细胞,并确定了最适合其冻存的方法。利用免疫细胞化学技术鉴定细胞,BMECs同时表达角蛋白18和β-酪蛋白,不表达波形蛋白,经验证培养的细胞是乳腺上皮细胞。(2)经不同浓度的S.aureus(0、10~1、10~2、10~3、10~4 CFU/mL)作用于细胞12h后,IL1RⅠ、IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达量分别在浓度10~2、10~4、10~3 CFU/mL时最高,不同浓度的E.coli(0、10~1、10~2、10~3、10~4 CFU/mL)作用于细胞12 h后,IL1RⅠ、IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量分别在浓度10~1、10~3、10~4 CFU/mL时最高。(3)分别利用浓度为10~1-10~4 CFU/mL的S.aureus、E.coli处理细胞,凋亡率随菌液浓度的增加而上升。(4)在添加10~2 CFU/mL S.aureus作用6 h时IL1RⅠmRNA相对表达量最高;在10~4 CFU/mL S.aureus作用9 h时IL-1βmRNA相对表达量最高;在10~3CFU/mL的S.aureus作用12 h时TNF-αmRNA相对表达量最高。在添加10~1CFU/mL的E.coli作用6 h时IL1RⅠmRNA相对表达量最高;在10~3 CFU/mL的E.coli作用9 h时IL-1βmRNA相对表达量最高;在10~4 CFU/mL的E.coli作用于12 h时TNF-αmRNA相对表达量最高。本研究发现不同浓度和不同时间点的S.aureus、E.coli对奶牛乳腺上皮细胞进行感染,细胞因子IL-1β、TNF-α和受体IL1RⅠ基因相对表达量存在差异性,并发现不同浓度的S.aureus、E.coli对细胞进行感染,凋亡率随菌液浓度的增加而上升。为进一步研究因细菌感染引起的乳腺炎致病机制提供理论依据。