研究背景与目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,是女性癌症死亡的最主要的原因。目前在乳腺癌治疗方面,手术治疗,化学药物治疗,放射性治疗及靶向治疗都取得了很大的进步。但是乳腺癌仍是影响女性健康的非常重要的原因。寻找新的治疗手段和作用机制仍是十分重要的。在药物研究中,倍半萜内酯类化合物非常的受到关注,它们呈现出一系列的生物学活性,如抗癌,抗炎,抗菌,抗氧化等。而小白菊内酯是从菊科植物中提取的倍半萜内酯类化合物。许多年来,该植物主要用于治疗发热,头痛,关节炎等疾病。近几年,研究发现,从菊科植物中提取的倍半萜内酯类化合物,小白菊内酯对各种肿瘤都有一定的治疗作用,如胰腺癌,前列腺癌,结肠癌,黑素瘤,胆管癌。同样地,相关研究也已表明小白菊内酯可抑制乳腺癌的进展。但具体的作用机制仍需探讨。自噬是被称为第二种细胞程序性的死亡途径,与凋亡有所不同。自噬可以通过溶酶体消除细胞内的器官和蛋白。通常情况下,自噬水平是比较低的,只有在受到刺激或营养缺乏等条件下,自噬水平升高。对于维持内环境的稳定,自噬过程是十分重要的。自噬过程如果无法发生,损伤的蛋白,器官无法消除而积累,正常的组织和器官则会处于有毒性的环境中,而影响其正常存活。细胞内大多数蛋白都受自噬途径的影响,是维持内环境稳定的一个非常重要的机制。自噬在癌症中所扮演的角色是非常复杂的。现在研究认为自噬是一把“双刃剑”。肿瘤细胞通过自噬以适应各种存活压力,如癌基因、缺氧、内质网应激、肿瘤微环境、药物作用等。另一方面,自噬过度激活也会引起细胞发生程序性死亡。基于此上研究背景,探讨小白菊内酯是否可引起自噬以及所引起的自噬相关作用机制对于此种新型药物对乳腺癌的影响是非常重要的。在乳腺癌细胞中,小白菊内酯可引起乳腺癌细胞的自噬和凋亡的过程。研究指出抗癌药物所引起的自噬过程可产生保护性的作用机制。基于此,小白菊内酯所引起的自噬过程的作用机制需要进一步验证,对于寻找新的治疗机制是非常重要的。方法:在本论文中,我们主要通过采用CCK-8实验测定小白菊内酯的IC50剂量。采用集落形成实验测定小白菊内酯对乳腺癌细胞的抑制作用。采用免疫荧光和自噬小体的形成来验证自噬过程的产生。采用流式细胞仪技术来验证细胞凋亡的发生。采用western blot技术证实小白菊内酯所引起自噬和凋亡过程的作用机制,观察PI3K,AKT,phosphorylation of AKT,mTOR,ATG13,ATG14的表达情况。同样地,可以通过western blot技术在蛋白水平上探讨Bcl-2,Caspase-3,P62,和Beclin1的表达情况。RT-qPCR在基因水平上观察ATG13,ATG14的表达情况。结果:1.CCK-8实验检测小白菊内酯对乳腺癌细胞的增殖影响结果如下:其24h对MCF-7细胞的抑制生长率为96%,89.1%,80.1%,62.5%,47.3%,36.6%,29.5%,48h的抑制生长率为90.6%,80.0%,66.3%,45.2%,34.5%,25.4%,18.7%。相比较之下,对MDA-MB-231细胞的抑制生长率就比较弱些,24h的为96.3%,90.0%,81.3%,65.9%,50.9%,38.3%,30.1%,48h的抑制生长率为89.4%,79.8%,67.3%,49.6%,34.2%,24.6%,19.7%。采用克隆形成实验进一步更为直观的检测小白菊内酯对乳腺癌细胞增殖能力的影响作用。实验结果显示处理组形成细胞集落的数量明显低于对照组。2.在MCF-7细胞中,经药物处理24小时之后,其药物浓度为4μmol/L,8μmol/L,其凋亡率为12.66%和21.79%。在MDA-MB-231细胞中,其处理药物浓度为5μmol/L,10μmol/L,凋亡率为12.24%,17.62%。Western blot结果显示在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与对照组相比,实验组Bcl-2表达水平降低,Caspase-3表达水平升高。3.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,经小白菊内酯该药物处理过的细胞,经MDC染色之后可以看到细胞内自噬泡的荧光点状分布。采用Western blot技术检测自噬相关基因的表达。Western blot结果显示与对照组相比,实验组自噬相关基因Beclin-1表达增高,P62表达降低。其次,采用免疫荧光染色技术进一步证实在实验组中Beclin-1水平表达增高。同样地,采用免疫荧光技术和PCR技术,结果显示:在实验组,ATG13,ATG14自噬相关基因高表达。4.采用Western blot技术分别检测PI3K/AKT/mTOR信号通路关键分子在蛋白水平的表达。结果显示:与对照组相比,实验组PI3K,AKT,phosphorylation of AKT,mTOR蛋白表达均降低。结论:1、小白菊内酯可以抑制乳腺癌细胞的生长2、小白菊内酯可以促进乳腺癌细胞的凋亡3、小白菊内酯可以促进乳腺癌细胞自噬过程的发生4、小白菊内酯可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路