【摘 要】
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目的:肾母细胞瘤（Wilms Tumor,WT）为儿童常见的恶性胚胎性肿瘤,其发病机制尚不清楚,目前研究认为可能涉及基因改变,染色体异常,以及遗传因素等。近年来,研究表明TGF-β1在WT中异常表达与肿瘤的转移,复发及细胞的侵袭能力相关。但是,其具体机制仍不明确。本研究拟探讨TGF-β1在WT中表达的意义,通过TCGA和GEO数据库对WT差异性基因进行分析,寻找TGF-β1介导的下游基因表达,利用
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目的:肾母细胞瘤（Wilms Tumor,WT）为儿童常见的恶性胚胎性肿瘤,其发病机制尚不清楚,目前研究认为可能涉及基因改变,染色体异常,以及遗传因素等。近年来,研究表明TGF-β1在WT中异常表达与肿瘤的转移,复发及细胞的侵袭能力相关。但是,其具体机制仍不明确。本研究拟探讨TGF-β1在WT中表达的意义,通过TCGA和GEO数据库对WT差异性基因进行分析,寻找TGF-β1介导的下游基因表达,利用WT细胞及动物模型,对TGF-β1受体及下游基因进行干预,阐明TGF-β信号通路在WT发生和发展的意义,为临床综合治疗WT提供新的思路。方法:第一部分:检测WT中TGFβ/Smad蛋白表达情况并探讨与临床资料相关性,通过抑制TGFβ/Smad信号检测其对WT肿瘤细胞和动物模型的影响:（1）通过免疫组织化学染色检测60例肾母细胞瘤及癌旁对照组织样本TGFβ1和P-smad2/3表达水平;（2）采用CCK-8,划痕实验,侵袭实验和流式凋亡实验分别检测TβRI抑制剂,TGFβ激动剂对G401细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡的影响;（3）构建WT动物模型,检测TβRI抑制剂对肿瘤细胞增殖的影响,并检测抑制剂对肝肾功代谢影响。第二部分:利用GEO及TCGA数据库筛选肾母细胞瘤核心基因:（1）采用R studio软件分别对GEO肾母细胞瘤数据集（GSE66405,G SE73209）和TCGA-Target-WT转录组测序结果进行差异性表达基因筛选,寻找三个数据集共同上下调基因;（2）采用David分析上调基因和下调基因富集的肿瘤信号通路;（3）利用Cytoscape软件和String进行蛋白交互网络分析,寻找到核心基因,GSEA分析核心基因受调控的上游基因;（4）免疫组织化学染色验证肾母细胞瘤核心基因的表达情况;（5）体外构建si-RNA模型,CCCK8,划痕实验和周期实验检测其对WT细胞的增殖,迁移,细胞周期调控的影响。第三部分:检测TGFβ1,c-MYC及CDC20在WT中表达相关性,抑制WT中TGFβ信号通路,检测其对下游MYC/CDC20介导细胞周期和EMT的影响:（1）WB检测肾母细胞瘤肿瘤组织中TGFβ1和cMYC和CDC20表达情况,Spearman分析其蛋白表达相关性;（2）采用TβRI抑制剂干预WT细胞系及荷瘤小鼠模型,WB检测及IP检测下游EMT相关蛋白（E-cad,N-cad,β-cat,CK）表达情况;（3）采用R as蛋白抑制剂干预WT细胞系,检测细胞周期相关蛋白表达情况;（4）沉默G401和SK-NEP-1中CDC20基因后,检测其细胞周期相关蛋白表达情况。结果:第一部分:（1）TGF-β1,P-Smad2/3蛋白在WT中表达明显增高,且与患儿临床分期与肿瘤侵袭转移明显相关;（2）抑制TGF-β1受体I能够明显减少WT细胞增殖,迁移和侵袭能力,且增加肿瘤的凋亡能力;（3）通过荷瘤小鼠实验,采用TβRI抑制剂能够明显减少肿瘤组织的增殖,且抑制剂不具有肝肾功损害。第二部分:（1）本部分研究发现GSE66405,GSE73029,TCGA-T arget-WT共同上下调基因为44个和272个,上调基因主要富集于Ce ll cycle,Cell division cycle。（2）蛋白交互网络分析Top链接基因发现CDC20核心,且有更多关联性,其主要受上游MYC等基因调控。（3）si-CDC20转染WT细胞系G401及SK-NEP-1能够显下抑制肿瘤细胞的增殖,迁移,同时,细胞在G2/M期停滞。第三部分:（1）TGFβ1和c-MYC和CDC20在WT中均表达增高,且三者具有正相关性;（2）抑制Ras蛋白后能够明显减少c-MYC,C DC20蛋白表达,并增加G2/M期蛋白（Securin and Cyclin B1 and C yclin A）表达水平;（3）抑制TβRI能减少N-cad,SMA,MMP7,β-cat蛋白表达水平,同时增加E-cad,CK表达表达;（4）si-CDC20能够明显增加WT细胞G2/M期蛋白（Securin and Cyclin B1 and Cyclin A）)表达水平。结论:WT中TGF-β/Smad信号通路的激活可能是其增殖,转移和侵袭的原因,抑制TGF-β/Smad信号通路通路后能够明显减少肿瘤的增殖,侵袭和迁移能力,其机制可能涉及TGFβ/Smad信号通路调控Myc/CDC20造成细胞紊乱及TGFβ介导的肿瘤EMT。
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