目的:1采用缺糖缺氧/复糖复氧方法建立大鼠心肌细胞损伤模型,附子人参不同配伍对其干预后,考察心肌细胞博动频率、细胞活力、凋亡率、相关生化指标SOD活性、MDA含量、LDH释放率、NO分泌量的影响等及Bcl-2、Bax、Caspases-3m RNA及蛋白表达变化,探讨附子人参配伍对心肌细胞保护作用的最佳药效比例及浓度。2附子具有强心、增加心肌收缩力的作用,但同时附子对心脏也会产生毒性,本文采用附子单独应用产生的大鼠心肌细胞毒性作用,逐渐增加配伍中人参的比例,探讨附子与人参在何种比例下,何种浓度时达到对心肌细胞的减毒作用。3附子、人参合理配伍应用对缺糖缺氧损伤大鼠心肌细胞具有保护作用,通过测定加入ERK1/2(细胞外信号调节蛋白激酶)信号转导通路抑制剂前后相应指标的变化,探讨其保护作用机制是否通过ERK1/2(细胞外信号调节蛋白激酶)信号转导通路实现。方法:1乳鼠心肌细胞分离培养取24h内新出生大鼠,置于超净工作台中,75%酒精消毒,无菌条件下取出心脏,剪成细小碎块,采用胰蛋白酶与胶原酶进行消化处理,采用差速贴壁分离法去除成纤维细胞,得到较高纯度的心肌细胞进行培养。2心肌细胞损伤模型的建立原代心肌细胞培养6天后,心肌细胞密度符合要求,自发博动频率稳定后,利用D-Hank’s液反复冲洗心肌细胞,降低葡萄糖浓度,确保其低于lmol/L,然后滴加Hank’s无糖液适量,置于缺氧盒中,将含量95%的N2混合气体,缓慢持续通入2h,取出心肌细胞培养板,弃去Hank’s液,放入CO2培养箱进行正常培养24h,即模拟体内心肌缺血再灌注。3附子人参不同配伍比例载药血清的制备取附子、人参药材饮片,按附子、人参0.5:1、1:1、2:1和4:1及附子、人参1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2共9种配伍比例混合,制备水煎液,放入4℃冰箱存储备用。选取100只清洁级Wistar雄性大鼠,随机分成10组,其中9组大鼠灌胃不同配伍比例的水煎液,第10组大鼠给予同体积生理盐水,每日给药1次,连续1周,于末次给药2h后,经股动脉取血,室温放置、离心、分离血清,于无菌工作台内0.22μm滤膜过滤,56℃水浴灭活30 min,放入-20℃冰箱存储备用。4检测指标及方法4.1心肌细胞自发博动频率心肌细胞经药物处理后,在规定的时间点将孵育有心肌细胞的多孔培养板从CO2培养箱中取出,置于倒置显微镜下,随机选择10个不同视野内10个原代心肌细胞进行观察,记录心肌细胞的博动频率(次/min),重复6次试验,计算平均心肌细胞博动频率(次/min)。4.2心肌细胞活力心肌细胞经药物处理后,在规定的时间点将孵育有心肌细胞的多孔培养板从CO2培养箱中取出,置入超净工作台内,吸弃其中液体,加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,摇匀,37℃孵育4 h,吸弃上清液体,加入100μl DMSO溶液,置于振荡器中轻轻摇动10min,待溶液中看不到蓝色颗粒,放入酶标仪中,将检测波长轻轻调节至490 nm,然后分别测定各个样品吸光度A,并计算心肌细胞的存活率。4.3心肌细胞凋亡率的流式检测取经药物处理后的心肌细胞,于规定的时间点利用Annexin V-FITC结合液195μl轻轻重悬沉淀心肌细胞,向悬浮心肌细胞溶液中加入Annexin V-FITC溶液5μl轻轻混合均匀,密封,用铝箔包绕避光,于室温(约25℃)下孵育10 min。再置入4℃预冷的离心机中,1000r/min离心3min,吸弃上清液,利用Annexin V-FITC结合液190μl轻轻重悬沉淀心肌细胞,向悬浮心肌细胞溶液中加入碘化丙啶染色溶液10μl轻轻混合均匀,密封,用铝箔包绕避光,置于冰上10 min,随即进行流式细胞仪分析检测,激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530 rim。4.4生化指标的检测(SOD、MDA、LDH、NO)心肌细胞经药物处理后,在规定的时间点根据SOD、MDA、LDH、NO试剂盒的要求,测定各组心肌细胞的OD值4.5分光光度计分析Caspase-3活性心肌细胞经药物处理后,根据Caspase-3试剂盒的操作方法,在规定的时间点测定,利用荧光分光光度法测定各组吸光度值。4.6利用westernblot检测Bcl-2、Bax及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达各组心肌细胞经药物处理后,以细胞裂解液提取心肌细胞Bcl-2、Bax及ERK1/2p-ERK1/2蛋白,按照BCA法进行蛋白定量。提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳法分离,电泳结束后,进行转膜,即将分离的蛋白质转到NC膜上,封闭孵育后加入一抗和二抗,进行孵育,再滴加适量荧光检测试剂,转入一体式荧光图像分析仪中,进行各条带积分光密度的扫描、分析。4.7利用RT-PCR检测Bcl-2、Bax和Caspases-3 m RNA表达各组心肌细胞经药物处理后,利用TRIzol试剂提取总RNA,再利用紫外分光光度计检测RNA的纯度,然后逆转录合成c DNA,利用Bcl-2、Bax和Caspases-3引物进行目的基因的检测。最后利用软件Sequence Detection software version 1.2.3分析RT-PCR实验的检测结果,即分析所测得各个样本的Ct值,再计算出各个目的基因的2-ΔΔCT值,进而得出不同组心肌细胞基因表达量的差别。5统计分析:用x±s表示试验数据,实验结果的多因素统计分析采用SPSS13.0软件进行。采用方差分析试验结果多组间差异的显著性,采用SNK检验试验结果的组间两两比较。具有显著差异性判断依据为P<0.05。结果:1附子人参配伍对缺糖缺氧/复糖复氧损伤大鼠心肌细胞的保护作用1.1对心肌细胞博动频率的影响在0~72h内,模型组、空白血清组与空白对照组比较,原代培养的心肌细胞博动频率显著降低,其P<0.05。与空白血清组相比较,不同配伍比例的附子人参组(0.5:1、1:1、2:1和4:1)心肌细胞自发博动频率均有不同程度的升高,除在作用6h时,附子人参(0.5:1)组、附子人参(4:1)组外,在6~48 h内差异均具有统计学意义(P<0.05),且在6~48 h内呈时效依赖关系,该结果表明:附子人参不同配伍对缺糖缺氧/复糖复氧所致损伤的原代大鼠心肌细胞具有一定保护作用。而在0~72 h内,附子人参(2:1)组心肌细胞的自发动博动频率均在不同程度上高于其他配伍组,其中48 h时,与其他3个配伍组比较均有统计学意义(P<0.05);24h和72h时,与附子人参(0.5:1)组、附子人参(4:1)组比较有统计学意义(P<0.05);作用时间为12h时,与附子人参(0.5:1)组比较有统计学意义(P<0.05),进一步表明附子人参(2:1)组对损伤心肌细胞保护作用最显著。1.2对心肌细胞活力的影响在0~72 h内,与空白对照组比较,模型组、空白血清组细胞活力显著下降(P<0.05),表明心肌细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤模型成功建立。在6~72h内,不同配比的附子人参(0.5:1、1:1、2:1和4:1)配伍组,与空白血清组比较,除附子人参(0.5:1)组外,各配伍组心肌细胞活力逐渐升高(P<0.05),且呈时效依赖关系,表明附子人参不同配伍对原代培养心肌细胞缺糖缺氧/复糖复氧造成的损伤具有一定抑制作用。在6~72 h内,附子人参(2:1)组心肌细胞活力均不同程度地高于其他配伍组,其中48 h时,与其他3个各配伍组相比均具有显著性差异(P<0.05);24h和72h时,与附子人参(0.5:1)组、附子人参(4:1)组比较有统计学意义(P<0.05),表明附子人参(2:1)组对损伤心肌细胞保护作用最显著。1.3对心肌细胞凋亡率的影响实验结果显示,在0~72h内,与空白对照组相比较,模型组,空白血清组心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与空白血清组比较,除附子人参(0.5:1)组在作用6h时,心肌细胞凋亡率无统计学意义(P>0.05)外,其余各附子人参配伍(1:1、2:1、4:1)组心肌细胞凋亡率在6~72h内均显著降低(P<0.05),其余时间内心肌细胞凋亡率有所下降,但不具有统计学意义(P>0.05)。各配伍组进行比较,附子人参(2:1)组心肌细胞凋亡率均显著低于其他配伍组(P<0.05)。且在作用48h时,附子人参(2:1)组心肌细胞凋亡率低于其他作用时间点。1.4对生化指标SODMDALDHNO的影响与空白血清组相比,不同配比的附子人参配伍(0.5:1、1:1、2:1和4:1)组心肌细胞SOD活性显著升高、MDA含量、LDH释放率、NO分泌量显著降低(P<0.05)。与其他3个配伍组相比,附子人参(2:1)组心肌细胞SOD活性显著升高、MDA含量、LDH释放率显著降低(P<0.05),附子人参(2:1)组,与附子人参(0.5:1)组、附子人参(4:1)组比较,NO分泌量差异具有统计学意义(P<0.05)。1.5对心肌细胞Caspases-3活性及Caspases-3m RNA表达的影响各组原代培养心肌细胞经附子人参配伍处理组后,与空白血清组相比,心肌细胞Caspases-3活性显著降低、Caspases-3m RNA表达显著下调(P<0.05)。表明附子人参各配伍组对损伤心肌细胞Caspases-3活性及Caspases-3m RNA表达的升高具有抑制作用。与其他各给药组相比,附子人参(2:1)组对细胞Caspases-3活性及Caspases-3m RNA表达的影响最显著(P<0.05)。1.6对心肌细胞Bcl-2 m RNA表达及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响各组原代培养心肌细胞经附子人参配伍处理组后,与空白血清组相比,心肌细胞Bcl-2 m RNA表达及Bcl-2的蛋白表达均显著上调,Bax的蛋白表达显著下调,均P<0.05,表明附子人参不同配伍组对心肌细胞损伤而导致心肌细胞凋亡具有抑制作用。与其他各给药组相比,附子人参(2:1)组对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响最显著(均P<0.05),说明附子人参按2:1配伍使用对心肌细胞的保护作用较显著。1.7不同浓度的附子人参对损伤心肌细胞保护作用的影响在考察附子人参配伍不同浓度对缺糖缺氧所致心肌细胞损伤的保护作用研究中,三个不同浓度的(15%、10%、5%)均对损伤心肌细胞有保护作用,其中心肌细胞博动频率、细胞活力、SOD活性、LDH释放率、Bcl-2m RNA表达、Bcl-2、Bax蛋白表达的检测结果显示,15%、10%浓度明显优于5%浓度(P<0.05),15%、10%浓度之间无明显差异。其他检测指标MDA含量、NO分泌量、心肌细胞凋亡率、Caspases-3活性及Caspases-3m RNA表达,15%、10%、5%3个浓度之间均无显著性差异(P>0.05)。2附子人参配伍对大鼠心肌细胞的减毒作用2.1对心肌细胞自发博动频率的影响在药物干预的0~4 h内,与空白血清组比较,附子人参(1:0)组心肌细胞自发搏动频率显著增加(P<0.05),表明附子增加了原代培养的心肌细胞自发搏动频率。而附子配伍不同比例人参的心肌细胞处理组,与附子人参(1:0)组相比较,心肌细胞自发博动频率显著降低(P<0.05),表明人参对附子引起的心肌细胞博动频率增加有缓解作用。其中附子人参(1:0.25)组在0~4 h内呈时效依赖关系,而附子人参(1:0.5)组对心肌细胞自发博动的影响与附子人参(1:0.25)组比较具有显著性差异(P<0.05),与附子人参(1:1)组、附子人参(1:2)组和空白血清组比较不具有显著性差异(P>0.05),表明附子人参配伍,人参比例达到0.5倍时,心肌细胞博动频率趋近空白血清组水平。2.2对心肌细胞活力的影响培养的原代心肌细胞经药物处理后,在1~4 h内,与空白血清组比较,附子人参(1:0)组细胞活力显著下降(P<0.05),表明附子对原代培养的心肌细胞具有损伤作用,导致心肌细胞活力下降,而附子配伍不同比例人参的处理组,与附子人参(1:0)组相比,心肌细胞活力逐渐升高,在2~4 h内,具有显著性差异(P<0.05),表明人参对附子引起的心肌细胞活力降低具有抑制作用。其中附子人参(1:0.25)组在0~4 h内呈时效依赖关系,而附子人参(1:0.5)组对心肌细胞的细胞活力的影响与附子人参1:1组、附子人参(1:2)组和空白血清组比较不具有显著性差异(P>0.05),在3~4 h与附子人参(1:0.25)组比较具有显著性差异(P<0.05),表明附子人参配伍,人参比例达到0.5倍时,心肌细胞活力趋近空白血清组水平。2.3对心肌细胞生化指标SOD、MDA、LDH、NO的影响与空白血清组比较,附子人参1:0组心肌细胞SOD活性显著降低,MDA含量、LDH释放率、NO分泌量显著升高(P<0.05),表明心肌细胞受到附子干预后,产生大量的自由基,导致心肌细胞损伤,凋亡。与附子人参(1:0)组相比,附子配伍不同比例人参的处理组,心肌细胞SOD活性显著升高、MDA含量、LDH释放率、NO分泌量显著降低(P<0.05),表明人参对附子引起的原代心肌细胞损伤具有一定的抑制作用。其中附子人参(1:0.5)组对心肌细胞SOD活性、MDA含量、LDH释放率、NO分泌量的影响与空白血清组比较不具有显著性差异(P>0.05),与附子人参(1:0.25)组比较具有显著性差异(P<0.05),表明人参比例为附子0.5倍时,即可抑制附子对原代培养心肌细胞的损伤作用。2.4附子人参配伍不同浓度的对心肌细胞减毒作用的影响与空白血清各浓度组比较,附子人参(1:0)各浓度组心肌细胞博动频率显著增加、活力显著降低、SOD活性显著降低,MDA含量、LDH释放率、NO分泌量显著升高(P<0.05),表明附子各浓度对原代培养的心肌细胞均具有损伤作用。与附子人参(1:0)各浓度组相比,附子配伍人参(1:0.5)的各浓度处理组,心肌细胞博动频率显著降低、细胞活力、心肌细胞SOD活性显著升高、MDA含量、LDH释放率、NO分泌量显著降低(P<0.05),表明附子配伍人参(1:0.5)的各浓度(15%、10%、5%)对心肌细胞损伤均有抑制作用,附子人参(1:0.5)组各浓度组之间比较,以上指标的变化无显著性差异(P>0.05)。2.5对心肌细胞Caspases-3活性及Bcl-2、Caspases-3 m RNA表达的影响培养的原代心肌细胞经药物处理后,与空白血清组比较,附子人参(1:0)组心肌细胞Bcl-2 m RNA的表达均明显下调,Caspases-3活性、Caspases-3 m RNA表达明显上调,均具有显著性差异(P<0.05),表明附子对原代培养的心肌细胞具有损伤作用,进而导致心肌细胞凋亡。而附子配伍不同比例人参的处理组,与附子人参(1:0)组相比,心肌细胞Bcl-2 m RNA的表达明显上调,Caspases-3活性、Caspases-3 m RNA的表达明显下调,均为显著性差异(P<0.05),表明人参对附子引起的心肌细胞毒性具有抑制作用,附子人参(1:0.5)组对Bcl-2、Caspases-3 m RNA及Caspases-3活性表达的影响与附子人参(1:0.25)组比较具有显著性差异(P<0.05),与空白血清组比较不具有显著性差异(P>0.05),表明人参比例为附子0.5倍时,即可抑制附子对原代培养心肌细胞的损伤作用。2.6对心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响培养的原代心肌细胞经药物处理后,与空白血清组比较,附子人参(1:0)组心肌细胞Bcl-2的蛋白表达显著下调,Bax的蛋白表达显著上调,均具有显著性差异(P<0.05),表明附子对原代培养的心肌细胞具有损伤,使心肌细胞凋亡。而附子配伍不同比例人参的心肌细胞处理组,与附子人参(1:0)组相比,心肌细胞Bcl-2的蛋白表达显著上调,Bax的蛋白表达显著下调,均为显著性差异(P<0.05),表明人参对附子引起的心肌细胞损伤具有抑制作用,附子人参(1:0.5)组对心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响与附子人参(1:0.25)组比较具有显著性差异(P<0.05),与空白血清组组比较不具有显著性差异(P>0.05),表明人参比例为附子0.5倍时,即可抑制附子对原代培养心肌细胞的损伤作用。3附子人参配伍对缺糖缺氧/复糖复氧损伤心肌细胞保护作用机制的研究与空白血清组相比较,附子人参(2:1)组对缺糖缺氧/复糖复氧损伤心肌细胞ERK1/2、Bcl-2以及ERK1/2磷酸化蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,Bcl-2 m RNA表达升高,Bax、Caspases-3 m RNA表达降低,均具有显著性差异(P<0.05)。附子人参(2:1)加入ERK抑制剂PD98059共处理后,即附子人参(2:1)+PD98059组对缺糖缺氧/复糖复氧损伤心肌细胞ERK1/2、Bcl-2、Bax及ERK1/2磷酸化蛋白表达量及Bcl-2、Bax、Caspases-3 m RNA表达量,与空白血清组相比较基本相当,不具有统计学意义(P>0.05)。结论:1附子人参配伍对缺糖缺氧/复糖复氧损伤大鼠心肌细胞具有保护作用,其中以附子人参配伍比例2:1效果最为显著,在考察附子人参配伍不同浓度对缺糖缺氧所致心肌细胞损伤的保护作用研究中,三个不同浓度的(15%、10%、5%)均对损伤心肌细胞有保护作用,15%、10%浓度优于5%浓度,但15%、10%之间无差异。2附子配伍不同比例的人参可抑制附子对心肌细胞的毒性作用,其中附子人参配比为1:0.5时,人参即可有效地抑制附子的毒性作用。15%、10%、5%各浓度对心肌细胞的减毒作用无显著性差异。3 ERK1/2信号通路可能涉及附子、人参配伍(2:1)对缺糖缺氧再灌损伤原代培养心肌细胞的保护作用。