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目的:观察自噬在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤中的作用,并初步探讨其机制。方法:1.运用不同浓度及时间点的ox-LDL处理HUVECs,采用免疫印迹技术检测自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I、beclin1及溶酶体相关膜蛋白lamp2a表达,透射电镜观察细胞超微结构,MDC染色自噬囊泡及荧光免疫标记MAP1-LC3,观察ox-LDL对HUVECs自噬水平的影响。通过观察培养上清中T-SOD、MDA含量,并用抗氧化剂维生素C(vitC)、维生素E(vitE)及植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)mAb干预,探讨氧化应激及LOX-1受体途径在ox-LDL影响HUVECs自噬水平中的作用。2.在自噬诱导剂雷帕霉素和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预下,通过MTT检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡、死亡及酶联免疫技术检测培养上清中ET-1、LDH含量,观察自噬对ox-LDL损伤HUVECs的影响。并通过定量HUVECs中Dil标记ox-LDL(Dil-ox-LDL)含量,观察Dil-ox-LDL与MDC、MAP1-LC3和lamp2a的细胞定位情况,初步探讨自噬对ox-LDL损伤内皮细胞作用的机制。3.采用透射电镜观察细胞超微结构,免疫印迹及Real-time PCR技术检测LC3、beclin1和p53蛋白、基因水平的变化,流式细胞技术检测细胞的凋亡、死亡,MTT检测细胞增殖,观察在ox-LDL损伤HUVECs过程中自噬、凋亡及坏死之间的关系。结果:1. MDC染色、荧光免疫细胞染色和透射电镜结果均显示ox-LDL给药后可诱导HUVECs发生自噬;免疫印迹技术结果显示,ox-LDL上调HUVECs LC3-II/LC3-I及beclin1蛋白表达的作用在0.5 h和6 h出现两个高峰。ox-LDL作用0.5 h和6 h也能显著上调HUVECs lamp2a蛋白的表达;减少细胞培养上清中T-SOD水平,增加其MDA含量。抗氧化剂vitC和vitE能部分性拮抗ox-LDL诱导的培养上清中T-SOD减少及MDA增加。ox-LDL诱导的LC3-II/LC3-I表达上调能被vitC和vitE抑制,却不能被LOX-1mAb抑制;LOX-1mAb能抑制ox-LDL引起的lamp2a表达上调,而vitC和vitE仅能抑制lamp2a晚期6 h的表达上调。2. ox-LDL作用6 h能被HUVECs大量吞噬,并促进HUVECs增殖,诱导细胞发生自噬、凋亡,增加培养上清中LDH、ET-1含量。3-MA在抑制ox-LDL上调自噬的同时能增加ox-LDL在HUVECs内的蓄积,增加ox-LDL诱导的细胞凋亡,降低细胞的活性。雷帕霉素可逆转其。另外Dil-ox-LDL与MDC、MAP1-LC3和lamp2a发生大量共定位现象,MAP1-LC3与lamp2a的共定位程度在ox-LDL作用组细胞明显高于对照组的。3.暴露于ox-LDL 6 h-24 h的HUVECs在超微结构依次出现以自噬、凋亡、坏死为主要特征的变化。ox-LDL也能上调LC3-II/LC3-I、beclin1、p53蛋白及LC3、beclin1、p53mRNA水平,其中对LC3-II/LC3-I和beclin1的上调高峰(0.5 h和6 h)略早于对p53的上调(1.5 h和12 h)。3-MA在抑制ox-LDL上调HUVECs LC3、beclin1基因、蛋白表达的同时,能增加ox-LDL诱导的细胞凋亡、促进细胞死亡;凋亡抑制剂z-vad-fmk在抑制ox-LDL诱导HUVECs p53基因、蛋白表达上调的同时,也能抑制ox-LDL诱导的LC3、beclin1基因、蛋白表达上调,对ox-LDL诱导的HUVECs增殖产生抑制作用。6 h时间点上调自噬能在不影响HUVECs凋亡、坏死的情况下,抑制ox-LDL诱导的细胞增殖。结论:ox-LDL能促进HUVECs增殖,并诱导其发生自噬、凋亡和坏死。ox-LDL对HUVECs的损伤与其被细胞吞噬后的降解障碍有关。自噬诱导剂雷帕霉素能通过减少ox-LDL在HUVECs的聚集,抑制ox-LDL诱导的细胞增殖及细胞因子异常分泌,从而对ox-LDL所致的HUVECs损伤起保护作用。抑制自噬则会通过增加ox-LDL在细胞的集聚,增加ox-LDL诱导的凋亡,促进细胞死亡,进一步加重ox-LDL诱导的细胞损伤。