继发性脑损伤直接影响创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)患者的生存率和后期功能恢复,因此,减缓继发性脑损伤的进程对患者的预后至关重要。近年,肠-脑轴在TBI病程发展中的作用日益受到关注。TBI所致的肠道损伤是伤后全身性炎症反应的始因之一,保护肠道功能对遏制机体的过度炎症反应和减轻继发性神经功能损伤具有重要意义。研究发现,肠道菌群对肠-脑轴具有关键的调控作用,并可进一步影响中枢神经系统的功能。有研究表明,益生菌可保护TBI伤后的肠道稳态。本课题组前期动物研究发现,乳酸杆菌的重要菌株——嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,LA)能够改善重型TBI小鼠回肠的形态及收缩能力。此外,通过HE脑组织染色,观察到LA干预后重型TBI小鼠脑水肿和神经细胞变性坏死有所改善,但该效应尚需进一步明确,其中的具体机制亦不清楚。因此,确证LA对于TBI后的神经功能是否具有保护作用,明确肠-脑轴在TBI后疾病发展中的作用和可能机制,解析临床针对TBI患者肠道保护相关医疗和护理措施对病情恢复的重要性,不仅可为临床提供一种对TBI伤后肠道和神经功能损伤均具有改善作用的新手段,亦可为未来深入开展基于肠-脑轴的临床治疗和护理提供理论依据。研究目的探究LA对重型TBI小鼠神经功能的影响及相关机制,解析TBI后的肠-脑轴理论对于临床病情监测及肠道护理的意义,为TBI患者的治疗和护理提供新思路。研究方法将雄性C57BL/6小鼠(6-8w,21±3g)随机分为3组:假伤组(Sham+vehicle)、损伤组(TBI+vehicle)和损伤+嗜酸乳杆菌组(TBI+LA)。TBI+vehicle和TBI+LA组小鼠进行重型TBI制模处理,Sham+vehicle组只开骨窗不进行打击,伤后自由饮食水。Sham+vehicle及TBI+vehicle组小鼠每天灌胃0.5ml生理盐水,TBI+LA组小鼠每天灌胃相同体积的LA混悬液(含菌1×10~100 CFU)。第1次灌胃时间为致伤后4小时。1.于TBI伤前和伤后1、3和7天对各组小鼠进行神经功能评分和转棒疲劳行为学功能检测;于TBI后第3、7天,通过免疫组织化学和Fluoro-Jade B染色检测各组小鼠脑缺损体积以及脑缺损区周围存活和变性神经元的数量。2.于TBI后第3天,通过干湿比重法、Evans blue定量和Western blot检测各组小鼠脑水肿、血脑屏障通透性变化以及紧密连接蛋白occludin的表达量。3.于TBI后第3、7天,通过免疫组织化学和免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)法检测各组小鼠脑缺损区周围皮层中胶质细胞聚集,以及炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量。4.于TBI后第3、7天,通过HE染色观察各组小鼠各肠段绒毛和隐窝结构的变化;通过Elisa法检测血清D-乳酸含量以测定各组小鼠肠道屏障通透性;通过Western blot法检测各组小鼠回肠紧密连接蛋白occludin的表达水平。5.于TBI后第3天,通过Realtime PCR和16S rRNA测序技术观察各组小鼠回肠粘膜上LA的定植情况和盲肠菌群结构的改变。6.于TBI后第3、7天,通过试剂盒和Realtime PCR技术检测各组小鼠血清脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、TNF-α和IL-1β的含量,以及损伤皮层Toll样受体4(Toll-like receptor 4,Tlr4)和髓样分化因子初次应答基因88(Myeloid differentiation primary response gene 88,Myd88)的mRNA表达水平。7.于TBI后第3天,通过免疫荧光染色观察各组小鼠回肠肌间神经丛神经元和胶质细胞网络的变化。研究结果1.嗜酸乳杆菌对重型TBI小鼠神经功能的影响(1)TBI前各组小鼠行为学表现基线水平一致,与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle小鼠伤后第1、3和7天的感觉运动功能显著下降;与TBI+vehicle组相比,LA能够改善小鼠伤后第3、7天的感觉运动功能。(2)与Sham+vehicle小鼠相比,TBI+vehicle组小鼠伤后第3、7天脑组织缺损体积和缺损区周围变性神经元数量增加;与TBI+vehicle组相比,LA干预3天和7天后可以显著增加缺损区周围存活神经元的数量,并明显减少变性神经元的数量,但对于小鼠脑缺损体积没有显著的影响。(3)TBI后第3天小鼠会出现脑水肿和血脑屏障通透性增加,紧密连接蛋白occludin表达下降;与TBI+vehicle小鼠相比,伤后第3天TBI+LA小鼠的脑水肿和血脑屏障通透性明显降低,损伤皮层occludin的蛋白表达水平显著增加。(4)TBI+vehicle与Sham+vehicle组相比,第3、7天小鼠缺损区周围皮层胶质细胞大量聚集、炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量增加;TBI+LA与TBI+vehicle组小鼠相比,缺损区周围皮层小胶质细胞和星形胶质细胞的总数量、活化小胶质细胞的数量以及炎症因子TNF-α和IL-1β的含量明显下降。2.嗜酸乳杆菌对重型TBI小鼠肠屏障功能的影响(1)与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组小鼠伤后第3或7天十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和隐窝深度显著降低;与TBI+vehicle组相比,LA能够显著增加小鼠伤后第3、7天回肠的绒毛高度和隐窝深度。(2)与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组小鼠伤后第3、7天小鼠肠道屏障通透性增高,回肠紧密连接蛋白occludin的表达量显著下降;与TBI+vehicle组相比,LA干预3或7天后,可以明显降低小鼠伤后肠道屏障通透性,并增加occludin的蛋白表达量。3.嗜酸乳杆菌对重型TBI小鼠肠-脑轴的影响(1)与TBI+vehicle组相比,LA干预3天后,可增加LA在TBI小鼠回肠粘膜的定植量。(2)TBI+vehicle小鼠伤后第3天的盲肠菌群与Sham+vehicle相比,α多样性降低,菌群结构组成显著改变,并伴随不同分类水平上细菌表达丰度的变化;与TBI+vehicle组相比,LA可以增加伤后小鼠盲肠菌群α多样性,菌群结构与Sham+vehicle组趋于一致,并使一些细菌的表达丰度有所恢复。(3)与Sham+vehicle组相比,TBI+vehicle组小鼠伤后第3、7天血清中LPS和TNF-α的含量增高;TBI+LA组与TBI+vehicle组小鼠相比,伤后3、7天血清中LPS和TNF-α的含量显著降低。(4)TBI+vehicle组与Sham+vehicle组相比,第3、7天小鼠损伤皮层组织Tlr4和Myd88的mRNA表达升高;与TBI+vehicle组小鼠相比,LA干预可以显著降低Tlr4和Myd88的mRNA表达量。(5)与Sham+vehicle组相比较,伤后第3天TBI+vehicle组小鼠回肠肌间神经丛神经元和胶质细胞的数量显著减少;与TBI+vehicle组相比,LA干预后小鼠肌间神经丛神经元和胶质细胞的数量明显增加。研究结论1.LA可以减轻重型TBI小鼠脑水肿,减少脑缺损区周围皮层神经元丢失,改善小鼠的感觉运动功能,该效应可能与其能够抑制伤后的神经炎症有关。2.重型TBI可破坏小鼠的肠道粘膜结构和屏障功能,LA可以改善TBI小鼠回肠的粘膜形态;降低肠道屏障通透性,其机制可能与增加了回肠紧密连接蛋白occludin的表达水平有关。3.LA可通过调节重型TBI后小鼠肠道菌群的结构,进而促进受损肠道屏障功能的恢复,降低外周LPS和TNF-α的表达水平,从而发挥对脑损伤的保护作用。此外,肠神经系统也可能参与到LA调节肠-脑轴,以促进TBI小鼠脑损伤恢复的作用中。