研究背景： 结直肠癌是常见的恶性肿瘤，在西方已成为恶性疾病主要死因之一。近年来，国内来自广州、天津、上海等地的数据也显示结直肠癌发病率逐年上升。散发性结直肠癌中国人群流行病学研究显示吸烟、饮酒、体重、家族史、饮食等环境暴露因素与其发病有关，但有关报道结论不尽一致。香港、新加坡中国人群流行病学研究显示直肠癌发病与吸烟有关，但上海、哈尔滨的报道则没有显示这种关联。同样，关于中国人群饮酒与结直肠癌发病的关系，中国北方、香港和浙江的报道结论不尽相同。关于体重、家族史与中国人群结直肠癌的发病关系则报道较少。因此，确定我国散发性结直肠癌流行病学特征对疾病的预防和控制有着重要意义。 尽管环境暴露因素在散发性结直肠癌的发病中起着重要作用，但处于相同暴露因素下只有极少数人患病以及结直肠癌的家族聚集现象，揭示了个体的内因——遗传易感性也起着关键作用。作为第三代多态性标记，单核苷酸多态性与恶性肿瘤的关系也成为近几年研究热点，但有关中国人群散发性结直肠癌与单核苷酸多态性关系目前缺乏大样本、多中心研究。MAPK信号转导系统中重要成员Mkk4基因曾经被认为是抑癌基因，但近年来亦有报道被认为是癌基因，这些研究显示了Mkk4基因在恶性肿瘤的发生中起着极为复杂的作用。前期研究发现该基因外显子突变在结直肠癌中极为少见，因此Mkk4基因启动子变异对其表达的调控可能在结直肠癌中有更为重要的意义。然而，Mkk4基因启动子单核苷酸多态性与恶性肿瘤包括结直肠癌的关系目前尚未见报道。基因—环境之间的相互作用在恶性肿瘤中起关键作用成为目前临床医师和流行病学家的共识，Mkk4基因启动子单核苷酸多态性与环境暴露因素交互作用在结直肠癌中的作用亦未见报道。 研究目的： 收集广州市多中心结直肠癌病例与社区健康人群相关资料，分析我国南方人群散发性结直肠癌流行病学特征；进行Mkk4启动子基因单核苷酸多态性分析，分析、筛选Mkk4启动子区有与结直肠癌有关联的单核苷酸多态性位点；分析Mkk4启动子区单核苷酸多态性位点与环境暴露因素交互作用在散发性结直肠癌的关系；分析Mkk4启动子区单核苷酸多态位点与蛋白表达的关系，从表达水平证实上述关联。 研究方法： 1、流行病学调查 1.1病例组来源 来自2002年7月到2008年12月中山大学附属第六医院、中山大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院、广东省人民医院、广州医学院附属肿瘤医院、广州市番禺医院的结直肠癌病例，共706例，所有病例均经病理证实，排除家族性腺瘤性息肉病和遗传性非息肉性结肠直肠癌。所有病例无血缘关系，均为汉族，均来自广州及周边地区。 1.2对照组来源 来自同期参加广州市社区健康体检项目10000名体检者，所有体检者均证实身体健康。按与病例组性别、年龄相匹配的原则，从10000名体检者中随机选出723名健康受试者作为对照组。对照组入选者均无血缘关系，均为汉族，均来自广州及周边地区。 1.3数据收集 病例、健康对照组均记录年龄、性别、身高、体重、吸烟、饮酒、家族史、月经史。吸烟累计少于100支烟者定义为不吸烟者；吸烟≥100支者定义为曾经吸烟者。曾经吸烟者中在受试前已戒烟一年以上定义为过去吸烟者；余下的就定义为当前吸烟者。与此类似，一周至少饮酒一次、累计时间一年以上者定义为曾经饮酒者；没有达到这一标准的则定义为不饮酒者。曾经饮酒者中受试前戒酒≥1年者定义为过去饮酒者；余下的则定义为当前饮酒者。体重指数≤23.9kg/㎡者定义为低体重或正常体重者，体重指数从24.0kg/㎡到27.9 kg/㎡之间者定义为超重者，体重指数≥28.0kg/㎡定义为肥胖。一级亲属和/或二级亲属有癌症家族史者定义为阳性癌症家族史，否则就定义为阴性癌症家族史。 2、基因分型 2.1标本收集 所有病例、对照组均抽血5ml，提取DNA，低温保存。 2.2单核苷酸多态性位点选择 以Genbank的单核苷酸多态性数据库为基础，按较少的等位基因变异频率不少于5％的原则，在Mkk4启动子区入选4个位点：-1304T>G，-1044A>T，—641C>G，—84T>C。进一步连锁分析，发现-1044A>T，—641C>G，—84T>C相互之间两两完全连锁不平衡。因此，我们选取-1304T>G，-1044A>T作为本课题的研究位点。 2.3聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性实验及测序 采用PCR—RFLP确定基因型。分别扩增包括-1304T>G位点、-1044A>T位点在内的片段，采用限制性内切酶SmlⅠ、TSP509Ⅰ酶切，根据限制性酶切片段长度多态性判断结果。由两个不知道受试者情况的实验人员判断。同时，PCR扩增片段测序，验证限制性酶切片段长度多态性判断结果。 2.4蛋白表达分析 收集含有-1304T>G、-1044A>T两位点不同基因型的散发性结直肠癌组织，总共40例，以免疫印迹测定其蛋白表达水平，比较Mkk4-1304T>G、-1044A>T两位点不同基因型对Mkk4蛋白表达的影响。 3、统计分析 卡方检验比较病例组和对照组性别、年龄、吸烟、饮酒、体重指数、家族史、月经史的差异；吸烟、饮酒、体重指数、家族史等暴露因素对散发性结直肠癌发病的影响采用logistic多因素回归分析。对照组-1304r>G、-1044A>T基因型进行哈迪—温伯格平衡检验和连锁平衡分析。各基因型对散发性结直肠癌发病的影响采用logistic多因素回归分析。分层分析中，通过logistic多因素回归模型以乘法效应分析了各基因型与性别、年龄、吸烟、饮酒、体重指数、家族史、月经史等环境暴露因素的交互作用。采用PS软件分析统计效能。采用假阳性概率分析检验来分析第一类错误几率。采用方差分析和线性回归模型比较不同基因型蛋白表达水平的差异。均采用双尾和P<0.05为有统计学意义。 结果： 1.饮酒、BMI≥24.0kg/㎡、阳性癌症家族史与中国南方人群散发性结直肠癌明显相关 吸烟与中国南方人群散发性结直肠癌无明显相关。与不饮酒者相比，当前饮酒者散发性结直肠癌患病风险增高，过去饮酒者散发性结直肠癌患病风险也增高。另外，散发性结直肠癌风险增高也与阳性癌症家族史、体重指数≥24.0kg/㎡明显相关。以结肠癌和直肠癌为层，分层分析显示当前饮酒者、体重指数≥24.0kg/㎡与散发性结肠癌和散发性直肠癌发病都有明显相关，过去饮酒者、阳性癌症家族史与散发性结肠癌发病明显相关，但与散发性直肠癌无明显相关。 2.-1304TG和-1304GG基因型与散发性结直肠癌患病风险降低明显相关 与-1304TT基因型比较，-1304TG罹患结直肠癌风险明显降低，-1304GG风险则更低，该位点基因型与散发性结直肠癌风险的相关性有显著趋势的等位基因剂量效应。-1304G变异基因型散发性结直肠癌风险降低的效应在年龄大于60岁，曾经饮酒者中更为明显。年龄和饮酒与-1304G变异基因型在降低结直肠癌罹患风险上有交互作用。-1044A>T多态则与散发性结直肠癌无明显相关。 3.-1304G—MKK4蛋白表达增高有关 免疫印迹实验表明散发性结直肠癌肿瘤组织中，-1304G变异基因型Mkk4蛋白水平明显高于-1304TT基因型。然而，-1044A>T多态与MKK4蛋白表达无明显相关。 结论： 中国南方人群中，吸烟不是散发性结直肠癌发病独立危险因素；当前饮酒、BMI≥24.0kg/㎡是散发性结直肠癌患病的独立危险因素，过去饮酒、阳性癌症家族史则是散发性结肠癌患病的独立危险因素；Mkk4基因-1304TG、-1304GG基因型能降低散发性结直肠癌患病风险，这种保护作用在年龄大于60岁和曾经饮酒者更为明显：Mkk4-1044A＞T多态与散发性结直肠癌无明显相关；Mkk4基因-1304G能上调蛋白表达。