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神经细胞缺血再灌注损伤是目前研究热点,细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要病理生理机制之一,Fas基因表达在细胞凋亡中起重要作用。RNAi技术能特异性地、有效地抑制靶基因的表达。故针对fas基因的RNAi可以降低缺血再灌注损伤时神经细胞的fas基因表达,从而降低凋亡率。目前国内尚无关于fas-RNAi干预神经细胞缺血再灌注损伤后细胞凋亡的研究报道。本实验构建针对fas基因的siRNA质粒,转染经NGF诱导后的鼠PC12细胞,24h后体外模拟法建立神经细胞缺血再灌注损伤模型,并于模拟再灌注后不同时间点检测凋亡相关指标。目的是探讨针对fas基因的RNAi对缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。本实验分四部分进行。实验一分别于模拟缺血30min,60min,90min,2h,6h等不同时间段后进行模拟再灌注,建立模拟神经细胞缺血再灌注损伤模型,并检测模拟再灌注后0h,3h,6h,12h,24h,72h等时间点的细胞凋亡率和死亡率。摸索一个适当的模拟缺血再灌注时间段,结果提示:在模拟缺血90min组,模拟再灌注损伤后细胞凋亡率高而死亡率相对低,适合进行针对细胞凋亡的基因干预研究。实验二体外模拟缺血90min后模拟再灌注法建立神经细胞缺血再灌注损伤模型,检测模型组与对照组fas、caspase-3基因表达水平及细胞凋亡水平的变化,结果提示:缺血再灌注损伤后,神经细胞fas、caspase-3表达水平增高,fas表达高峰早于caspase-3基因表达高峰,而caspase-3基因表达时间曲线与细胞凋亡水平变化曲线一致。实验三针对fas基因进行siRNA质粒设计与构建,转染NGF诱导的鼠PC12细胞,24h后模拟缺血再灌注损伤,检测fas mRNA、fas蛋白表达水平。结果提示fas-siRNA能明显降低缺血再灌注损伤后神经细胞内fasmRNA、fas蛋白的表达,提示该质粒有能有效抑制fas基因的表达。实验四检测质粒转染及模拟缺血再灌注损伤后,各组细胞caspase-3活性、细胞凋亡水平的变化。结果显示:fas-siRNA转染后caspase-3活性明显降低、细胞凋亡率明显降低,提示fas-siRNA可以下调caspase-3的活化,降低细胞凋亡率,从而起到脑保护的作用。综上,本实验结果提示:应用经NGF诱导的鼠PC12细胞,体外模拟法可有效地建立神经细胞缺血再灌注损伤模型。模拟缺血90min后模拟再灌注损伤,细胞凋亡率高而死亡率相对较低,适合用于基因干预后分子生物学及细胞形态学变化的观察。针对Fas基因的siRNA质粒可有效地抑制Fas基因的表达,降低缺血再灌注损伤后的Fas mRNA和蛋白水平以及caspase-3活性,从而降低细胞凋亡率。本试验的结论:Fas-RNAi可以有效地下调凋亡基因Fas的表达,降低神经细胞缺血再灌注损伤后的细胞凋亡率,从而起到脑保护的作用。