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辣椒疫病是一种在世界范围内的土传病害,也是我国辣椒生产上广泛发生的主要病害之一,近年来由于集约化种植,重茬严重,导致辣椒疫病日趋严重,引起大幅度减产,给辣椒生产带来了极大的危害。辣椒疫病病原是辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici),是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎,寄主范围广,给我国的及世界各国的农业生产造成巨大的经济损失。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传,抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。其中细胞壁降解酶在病害致病关键因子之一,包括角质酶(cutinase),果胶酶(pectinase),纤维素酶(cellulase),半纤维素酶(hemicellulase),蛋白酶(protease)等。而果胶酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶甲基酯酶(PME),果胶裂解酶(PL)。果胶裂解酶(PL)是许多植物病原菌分泌的一种果胶酶,能降解植物细胞壁,许多病原真菌,卵菌,细菌在侵染过程都能分泌果胶裂解酶。本文以辣椒疫霉菌为研究对象,克隆了辣椒疫霉果胶裂解酶基因,并进行体外表达研究。以辣椒疫霉强致病和果胶裂解酶活性高的菌株为实验材料构建的DNA文库,借助Pool-PCR技术分离了10个果胶裂解酶基因。对基因结构分析发现10个pel基因具有较高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点,所编码的蛋白具果胶裂解酶的保守序列和蛋白活性位点。本研究发现,辣椒疫霉pel基因与其他疫霉pel基因具高度保守序列,也证明了辣椒疫霉菌在自然界中的分类地位。并且对其中一个基因构建质粒进行体外诱导表达,制备了多克隆抗体,借助蛋白印记杂交验证了重组蛋白的免疫活性,利用RT-PCR技术检测了其在发病辣椒叶片内的表达情况,其具体研究结果如下:1、Pool-PCR法筛选基因文库,分离了10个果胶裂解酶基因从GenBank中下载若干pel基因,同源比对设计多对引物,然后进行反复筛选,分离了3个全长和7个非全长基因。将所克隆的10个基因经过Blast搜索,结果显示全部为果胶裂解酶基因。经过DNAman软件处理分析了这10个基因的基本结构,最大开放阅读框长度为1200-1800 bp,编码370-500个氨基酸,预测氨基酸分子量为37-55kDa。利用SignalP 3.0 server和NetNGlyc 1.0 server对这10个基因的信号肽和N糖基化位点进行预测,信号肽长度一般为21-22个氨基酸,N-端糖基化位点以1个的居多,只有pcpel1基因有6个糖基化位点。10个基因的理论PI值差异较大。2、扩增非全长的pcpel基因使用两种方法扩增非全长基因的未知端序列:(1)RACE法:将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养7天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用Trizol法提取总RNA,经反转录酶作用,合成cDNA,作为模板,以通用引物(USP)和基因特异引物(GSP)进行第一轮PCR;以第一轮产物做模板,用巢式特异引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)进行第二轮PCR,目的片段回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,将两个非全长的基因补充完整,获得了理论全长基因。(2)TAIL-PCR法:将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养5天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用CTAB法提取总DNA,作为模板,以随即简并引物(AD)和基因特异引物(GSP)进行第一轮热不对称交错PCR;以第一轮产物做模板,用AD引物与第二轮GSP引物进行第二轮PCR,以此类推第三轮,直到得到已知序列的侧翼序列,经电泳检测、PCR产物回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,最终将非全长的基因补充完整,获得了4个基因的理论全长序列。3、pcpel1的真核表达根据已经克隆的pcpel1基因序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K/ pcpel1,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆。重组质粒经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,重组蛋白进行了特异表达,分子量大小约为65kDa。4. RT-PCR和Western Blot利用SDPH-33接种的4-6叶辣椒叶片,提取发病叶片的总RNA,合成cDNA。根据pcpel1的序列设计特异性引物,用RT-PCR技术检测接种叶片内pcpel1的表达情况。结果发现,接种后pcpel1在发病辣椒体内均能表达,其表达量随着时间的延长而加强,第七天表达量最高。通过将酵母分泌的PCPEL1蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western blot分析结果进一步表明,转基因酵母成功表达,重组抗原有良好的免疫活性,多克隆抗体具有较高特异性和灵敏度,重组蛋白与制备的抗体特异性结合。本实验的结果表明pcpel1是编码辣椒疫霉果胶裂解酶基因家族中起致病作用的关键基因之一。