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斑马鱼（Danio rerio）作为重要的模式生物之一,在研究天然免疫应答方面具有独特的优势,受精后的3-4周内只具有天然免疫,不具有获得性免疫。Notch信号通路在斑马鱼胚胎的发育过程中具有重要的作用,有研究发现,Notch信号通路在获得性免疫应答中同样行使功能。然而,关于Notch信号通路在天然免疫应答过程的调控机制仍不明了。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种人兽共患的主要病原之一,既可以感染水生动物,又可以感染人类,造成的后果严重,但是关于其具体的致病机制还有待深入研究。本文用副溶血弧菌感染3 dpf（days post fertilization）的斑马鱼幼鱼2h,通过转录组测序分析转录水平差异表达基因的类型,初步研究了Notch1a信号通路在天然免疫应答中的作用机制。首先通过比较浸泡感染与尾静脉注射感染两种感染方式下野生型斑马鱼的转录组数据,发现浸泡感染差异表达的基因为602个,其中427个基因下调,175个基因上调,已报道的参与天然免疫的基因15个,分别为il11a、ccl34、tnfb、ccl20a、cxcr4a、cxcl3、fosl1a、cmya5、c3a、c8a、c8b、mmp13、ctslb、atf3和arg2;注射感染的差异表达基因为359个,其中246个基因下调,113个基因上调,已报道的参与天然免疫的基因20个,分别为il1b、il6、il34、tnfa、ccl19b、cxcr3、cxcl3、cxcl18b、tnfb、ccl20a、ccl35.1、irak3、nfkbiaa、fosl1a、fosab、rel、c5、ncf1、ctslb和mpeg1。在细胞因子相关基因方面:浸泡感染组中有6个基因显著性差异表达,其中il11a和ccl34显著性下调,tnfb、ccl20a、cxcr4a和cxcl3显著性上调;注射感染组中有11个基因显著性差异表达,其中il1b、il6、il34、tnfa、ccl19b、cxcr3、cxcl3和cxcl18b显著性下调,tnfb、ccl20a和ccl35.1显著性上调。在补体系统方面:浸泡感染转录组中cmya5、c3a、c8a和c8b 4个基因显著性下调;在注射感染的转录组中c5基因显著性下调。浸泡感染中差异表达的602基因显著性富集到632个GO term和101个KEGG信号通路中;注射感染中差异表达359个基因显著性富集到223个GO term和13个KEGG信号通路中。说明在两种不同的感染方式下,所引起的天然免疫应答的基因和途径不同,相比较而言,浸泡感染的方式能够激活补体系统的广泛应答,影响到的GO term和KEGG信号通路更加广泛,涉及到的差异表达基因更多;而尾静脉注射感染中TLR通路首先被启动,细胞因子相关基因广泛差异表达,影响到的GO term和KEGG信号通路则较为集中,涉及到的差异表达基因相对较少些。之后通过CRISPR/Cas9技术对notch1a进行敲除,得到了notch1a缺陷的纯合突变体。用副溶血弧菌尾静脉注射感染3dpf的notch1a-/-斑马鱼幼鱼2h,对照组注射PBS,并进行转录组测序。发现有986个基因差异表达,TLR信号通路中转录因子irak3和nfkbiaa基因显著性上调。并与尾静脉注射感染副溶血弧菌的野生型斑马鱼的转录组测序结果进行比较,发现免疫相关基因cnksr3、appa、anxa1c、pcdh11、neo1b、arr3b、tiaf、cxcl3、il1b、il34和ccl35基因在Notch1a存在和缺失的情况下,受到副溶血弧菌感染时均显著性上调。il34和ccl35在两个组别中虽然均是显著性上调,但两个组别间同样存在显著性差异,在notch1a缺失组中表达水平显著低于野生型斑马鱼组,说明il34和ccl35基因可能由Notch1a信号通路调控,且为正反馈调节。免疫相关基因arr3b、tiaf、cxcl3和il1b可能不是由Notch1a直接调控,所以在两个组别中并无显著性差异。基因cxcl18b、cxcr3、irak3、nfkbiaa、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb的表达则在野生型和notch1a-/-的转录组中表达模式相反,在野生型组中显著性下调,而在notch1a-/-组中显著性上调,说明这些基因在天然免疫过程受Notch1a通路的负反馈调节。对于GO富集进行显著性分析比较,发现当Notch1a缺失时,斑马鱼受到Vp感染后,免疫相关的GO term没有显著性差异,相反在野生型中显著性差异的GO term中细胞因子活性、细胞因子受体结合、免疫应答、趋化因子活性和趋化因子受体结合均为免疫相关。在KEGG富集方面分析发现在两个组别中均不存在免疫相关的通路的差异表达,说明感染2h并不会引起信号通路的广泛差异。表明Notch1a在Notch信号通路中可能通过抑制irak家族及NFκB家族基因来抑制TLR通路的转导,从而在副溶血弧菌感染3dpf斑马鱼2h时起到负向调节nfkbiaa、cxcl18b、cxcr3、il11r、c3a、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb等基因的表达从而调节天然免疫应答。总而言之,我们不仅得到了在浸泡感染与尾静脉注射感染这两种不同感染方式下的斑马鱼的标志性应答基因,更是发现在Notch1a受体介导的信号通路在免疫应答调控中具有重要作用,为后续研究Notch通路在斑马鱼天然免疫应答过程中的调控机制研究提供新的证据和研究思路。