论文部分内容阅读
肠炎沙门氏菌是引起人或牲畜急性胃肠炎的主要病原菌,感染后的症状为腹泻、呕吐、发热等,是常见的食源性致病菌。这种细菌不仅会提高家禽的发病率和死亡率从而造成严重的经济损失,而且还会将被污染家禽产品作为肠炎沙门氏菌的载体来危害人类的健康。据统计,每年由沙门氏菌引起的急性胃肠炎病例数占食物中毒总数的40%-60%,在我国,由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。如何预防和检测肠炎沙门氏菌已成为国际公共卫生的一个重要课题。传统的细菌检测方法存在灵敏度低、准确度低、检测周期长、操作繁琐等缺点,并不适用于食品现场的检测应用。基于现状开发一种快速检测肠炎沙门氏菌的方法势在必行。近年来,基于适配体（Aptamer）指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）已成功应用到多个领域的实际样品检测中。它具有靶物质范围广,筛选特异性好,亲和力高,周期短,易于运输和保存等优点,被认为是抗体的替代品。本研究主要通过对肠炎沙门氏菌特异性适配体的筛选,并结合表面增强拉曼光谱技术,建立一种快速检测肠炎沙门氏菌的方法。本研究内容主要包括以下两个方面:（1）肠炎沙门氏菌特异性适配体whole-bacteria-SELEX（whole-bacteria Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）筛选与评价。以肠炎沙门氏菌为目标物,与随机寡核苷酸文库孵育并且分离未结合的ss DNA,将结合的ss DNA富集,进行15轮筛选,获得高亲和力、高特异性的适配体文库。通过单克隆测序和二级结构分析,获得了适配体候选序列。通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）技术与流式细胞术分析候选适配体亲和力,通过表面增强拉曼光谱分析候选适配体的特异性,获得与肠炎沙门氏菌高亲和力和特异性的核酸适配体,适配体序列为:5′-TTTTTGCGATCCAAGCTTCTTCAATTGGAGTGCTACCGAGATACATGGGTG GGCTCA AACAATCGTGGGCTCGCTTGATACTAGACTGCACATCT-3′。（2）表面增强拉曼技术快速检测肠炎沙门氏菌方法的建立。将肠炎沙门氏菌与经折叠处理后的特异性核酸适配体结合,孵育后将未结合和低结合的核酸适配体洗涤分离。采用纳米银原位还原法还原了肠炎沙门氏菌和特异性适配体复合体表面的银,使之形成纳米银壳。用拉曼光谱仪收集复合物表面上的拉曼光谱信号,可以快速、直观的检测出目标细菌。本实验采用全细菌指数富集的配体系统进化技术（whole-bacteria-SELEX）筛选肠炎沙门氏菌特异性核酸适配体,并采用ELISA技术与SERS技术对筛选出的适配体亲和力及特异性进行评价,建立肠炎沙门氏菌检测方法。将Aptamer4与肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等5种混合菌结合,结果表明,通过SERS技术可特异的检测出肠炎沙门氏菌,且该方法重复性较好,其最低检测限的细菌浓度为102 cfu/m L。且在猪肉样品的检测中,肠炎沙门氏菌的回收率为93.37%～100.18%。证明该方法快速、灵敏、准确可在食品生产加工运输过程中实现快速检测。