【摘 要】
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背景:急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）是常见的恶性血液肿瘤。尽管近年来B-ALL患者的治疗方法和治疗效果有了明显进步,但复发/难治性B-ALL的治疗手段仍然有限,预后欠佳。目前以CD19作为靶点的CART在治疗CD19阳性的复发/难治性B-ALL中取得了令人瞩目的成就,但仍有较高的复发率;CART细胞在体内增殖能力低并且对肿瘤细胞杀伤效率低,可能是导致复发/难治性B-ALL的治疗效果不理想的一个
【基金项目】
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项目名称:广西八桂学者科研团队，项目合同编号:2016A07，项目来源:广西壮族自治区人民政府； 项目名称:PD-1纳米抗体增强肿瘤特异性CTL抗癌效应及机制研究，项目合同编号:81773254，项目来源:国家自然科学基金项目； 项目名称:广西纳米抗体国际联合研究中心，项目合同编号:AD17195001，项目来源:广西科技基地和人
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背景:急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）是常见的恶性血液肿瘤。尽管近年来B-ALL患者的治疗方法和治疗效果有了明显进步,但复发/难治性B-ALL的治疗手段仍然有限,预后欠佳。目前以CD19作为靶点的CART在治疗CD19阳性的复发/难治性B-ALL中取得了令人瞩目的成就,但仍有较高的复发率;CART细胞在体内增殖能力低并且对肿瘤细胞杀伤效率低,可能是导致复发/难治性B-ALL的治疗效果不理想的一个重要原因。因此,制备一种新型的靶向CD19且具有高效抗肿瘤活性的CART细胞是当前急需解决的问题。目的:构建分泌CTLA-4纳米抗体靶向CD19的新型CAR T细胞（CD19-CTLA-4/Nb CART）,通过体内外实验验证其抗肿瘤效应。为CAR T细胞抗肿瘤研究提供新的技术手段和思路。方法:1.构建 CAR 基因序列,包括 Mock、Irr-CTLA-4/Nb CAR、CTLA-4/Nb CAR、CD19/Nb CAR、CD19-CTLA-4/Nb CAR 5组。将 CD19-CTLA-4/Nb CAR基因连接于GV400慢病毒载体,通过双酶切方案鉴定带有目标基因序列的重组慢病毒载体是否构建成功。通过测序鉴定重组慢病毒载体中目的序列是否成功插入。将慢病毒载体转染293T细胞后,通过RT-PCR法验证目标基因是否能在细胞中成功表达。2.通过三质粒包装系统将重组载体包装成慢病毒,利用荧光计数法测定慢病毒滴度。通过慢病毒转染正常人PBMC细胞,构建Mock、Irr-CTLA-4/Nb CAR T、CTLA-4/Nb CAR T、CD19/Nb CAR T、CD19-CTLA-4/Nb CAR T细胞,通过流式细胞术检测各组CAR T细胞GFP和His-tag的表达情况,通过ELISA检测各组CAR T细胞培养上清分泌的CTLA-4纳米抗体含量。3.通过流式细胞术检测靶细胞细胞表面CD19蛋白分子表达情况。将各组CART细胞与用丝裂霉素C预处理过的Raji共同孵育,通过流式细胞术检测各组CAR T在Raji细胞刺激下的增殖能力,并通过流式细胞术检测各组CART细胞表面活化分子CD25、CD69的表达量。4.将各组CAR T细胞与Raji细胞共同孵育后通过流式细胞术检测各组CART细胞对Raji细胞的杀伤能力。ELISA检测各组CART细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-2含量,ELISPOT检测各组CAR T细胞经靶细胞刺激后分泌IFN-γ的T细胞数目。5.构建NOD/SCID荷瘤小鼠模型,通过尾静脉注射CAR T进行治疗,监测小鼠生存期以观察各组CAR T细胞体内抗肿瘤作用。结果:1.成功构建带有 Mock、Irr-CTLA-4/Nb CAR、CTLA-4/Nb CAR、CD19/Nb CAR、CD19-CTLA-4/Nb CAR序列的重组慢病毒载体,测序结果表明重组载体中CD19-CTLA-4/Nb CAR基因的序列正确,重组载体转染293T细胞后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明重组载体基因能在细胞中成功表达。2.通过三质粒系统包装慢病毒,用荧光计数法测定慢病毒滴度在2× 107-5× 107TU/mL 之间。流式结果显示 Mock、Irr-CTLA-4/Nb CAR T、CTLA-4/Nb CAR T、CD19/Nb CAR T、CD19-CTLA-4/Nb CAR T 细胞GFP和His-tag表达率均高于40%,表明各组CART构建成功,ELISA检测结果显示CD19-CTLA-4/Nb CART细胞分泌CTLA-4纳米抗体含量为 237.3±3.2 ng/mL,表明成功构建 CD19-CTLA-4/Nb CAR T 细胞。3.流式细胞术检测结果显示Raji细胞高表达CD19分子。CD19-CTLA-4/Nb CAR T细胞在Raji细胞刺激下增殖效率高于其余对照组。CD19-CTLA-4/Nb CART细胞与Raji细胞共孵育后,通过流式细胞术检测到表面活化分子CD25、CD69表达升高。4.流式检测结果显示CD19-CTLA-4/Nb CAR T细胞对高表达CD19的Raji细胞有较好的杀伤效果。ELISA结果显示CD19-CTLA-4/Nb CART细胞相比于其他对照组TNF-α、IL-2分泌量增加。ELISPOT结果显示CD19-CTLA-4/Nb CAR T细胞分泌IFN-γ的T细胞数量明显高于对照组。5.治疗结果表明CD19-CTLA-4/Nb CAR T细胞能有效延长NOD/SCID荷Raji小鼠生存期。结论:本研究成功构建了分泌CTLA-4纳米抗体靶向CD19新型CART细胞,其在体内外对CD19+肿瘤细胞均有良好的抗肿瘤效果,为急性B淋巴细胞白血病的治疗提供了一种新的策略。
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