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目的:实验的目的在于建立体外分离、扩增培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,及描述其生物学的特征。了解骨形态发生蛋白-7(BMP-7)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)联合诱导人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化,通过深入认识两种细胞因子相互之间的作用,可给软骨组织工程的种子细胞来源提供一种新的途径。 方法:1)实验采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合分离人 BMSCs,将分离得到的BMSCs进行0.4％台盼蓝染色,并计算细胞的活性。将得到的细胞用含15％胎牛血清的DMEM-LG普通培养,待细胞80％以上融合后用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化传代,将传代至第四代细胞。取传代至第四代细胞行流式细胞表面抗原 CD34/CD44/CD45/CD29/CD90鉴定。2)实验共分四组,对照组 A组不加任何生长因子,实验 B组加入800ng/ml VEGF,C组加入200ng/ml BMP-7,D组加入200ng/ml BMP-7+800ng/ml VEGF进行向软骨诱导培养,诱导第21天后终止培养,各组间行细胞增殖比较,苏木素伊红(HE)染色观察各组细胞形态学改变、各组行 RT-PCR检测软骨细胞Ⅱ型胶原 mRNA表达水平、Western blot测定软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达水平,比较各组间差异。 结果:1)苏木素伊红(HE)染色示:A组:软骨细胞稀疏、着色均匀、边界清晰,以椭圆形、多角形为主,胞浆呈紫红色,胞核呈蓝色以圆形、椭圆形为主;其余 B、C、D组,软骨细胞数量增多,着色均匀、边界清晰,以椭圆形、多角形为主,胞浆呈紫红色,胞核呈蓝色以圆形、椭圆形为主。2)在 A、B、C、D四组诱导培养21天后, RT-PCR法检测细胞Ⅱ型胶原 mRNA的表达水平分别为0.2851±0.0102、0.3343±0.1210、0.5122±0.0937、0.7162±0.1032,各组间差异均有统计学意义(P<0.01);Western blot测定Ⅱ型胶原蛋白表达水平分别为0.3292±0.0067、0.4717±0.0062、0.6175±0.0055、0.7803±0.0052,各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论:通过密度梯度离心并结合贴壁培养的方法,能够分离出较纯的BMSCs,后经过培养及扩增后能获取一定数量的BMSCs,基本上能满足组织工程的需要。采用细胞因子 BMP-7和VEGF的联合应用比较单个细胞因子可以明显促进骨髓间充质干细胞增殖,并能促进诱导其向软骨细胞表型分化。