目的通关藤系萝摩科牛奶菜属植物通关藤Marasdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.的干燥藤茎,为傣医传统抗肿瘤药物,在云南、贵州民间广泛用于治疗癌症,C21甾体类化合物为其主要活性成分,已明确证实有抗癌作用。其单味制剂“消癌平”有明显的抗肿瘤作用,在临床上用于治疗各种癌症,如食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌、宫颈癌、白血病等。疗效良好,并可配合放疗、化疗的辅助治疗,具有增加化疗药物疗效的作用,还可提高患者的机体免疫力,延长生存期。但是,关于通关藤抗肿瘤的物质基础和作用机制尚不清楚。本课题在傣医理论的指导下,结合现代研究技术,系统研究了通关藤的皂苷类成分,探讨了通关藤抑制肺癌A549细胞增殖的药效物质基础,并对通关藤C21甾体类化合物体外抗A549细胞生长和转移的作用机制进行了初步研究,以期为通关藤的开发利用提供参考。方法1、以通关藤总皂苷提取率为指标,采用Box-Behnken响应面法考察乙醇浓度、液料比和提取温度对总皂苷提取率的影响;以总皂苷洗脱率为指标,以乙醇洗脱浓度为影响因素,考察通关藤总皂苷的大孔吸附树脂纯化工艺。2、采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20、ODS柱、半制备液相等多种色谱方法对通关藤乙酸乙酯萃取部位进行系统的化学成分分离纯化,通过ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMBC、HSQC、NOESY 等波谱学方法鉴定所分离得到的化合物结构。3、采用CCK-8法对通关藤的不同部位以及分离的化合物在体外抑制肺腺癌A549细胞增殖的活性进行筛选。4、采用划痕实验和Transwell实验检测四种具有良好抑制A549细胞生长活性的C21甾体类化合物(TGT-7、9、13和15)对A549细胞迁移和侵袭能力的影响。5、分别采用流式细胞术结合PI/RNase染色、Annexin V-FITC/PI双染、JC-1染色和DCFH-DA染色检测TGT-7、9、13和15对A549细胞周期时相分布、细胞凋亡、线粒体膜电位和细胞内活性氧水平的影响。6、采用Western Blot方法检测细胞的转移、侵袭和凋亡相关蛋白,从蛋白水平上分析TGT-7、9、13和15对A549细胞迁移、侵袭和凋亡的作用机制。结果1、最佳提取工艺条件为:乙醇浓度85%,液料比18.5:1(mL/g),提取温度80℃,该方法3次验证试验结果显示:通关藤总皂苷平均提取率为4.80%(RSD=1.06%,n=3),与预测值4.89%接近,偏差为1.84%;最佳纯化工艺条件为采用D101型大孔吸附树脂,以45%乙醇为洗脱溶剂除杂,再用90%的乙醇进行纯化,该方法3次验证试验结果显示:通关藤总皂苷含量实测值平均为 62.45%(RSD=0.88%,n=3)。2、从通关藤乙酸乙酯部位共分离鉴定了 20个化合物,其中15个为C21甾体类化合物。3个是新化合物,分别是11α-O-benzoyl-12β-O-tigloyltenacigenin B(15)、6-hydroxy-4-methyl-7-propan-10-methylidene-4-cyclododecene-1-one(16)、2-牛奶菜双糖酸甲酯-牛奶菜双糖酸钠(18),还有1个化合物升麻醇(14)为首次从通关藤中分离得到。3、通关藤的不同萃取部位及总皂苷体外对A549细胞的生长抑制作用强弱为:纯化总皂苷>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位。通关藤化合物对A549细胞生长抑制作用的实验结果表明有7种C21甾体皂苷体外对A549细胞生长有一定的抑制作用,其中6种活性较好,分别为Marsdenoside C(TGT-7)、Marsdenoside A(TGT-8)、11α-O-tigloyl-12β-0-benzoyltenacigenin B(TGT-9)、1 1α-O-2-methylbutyryl-12β-0-tigloyltenacigenin B(TGT-10)、1 1-α-O-2-Methylbutyryl-12β-0-benzoyltenacigenin B(TGT-13)和 11α-O-benzoyl-12β-O-tigloyltenacigenin B(TGT-15),对 A549 细胞的 IC50分别为(28.36± 1.96)μM、(78.14±1.85)μM、(44.01 ± 1.74)μM、(77.47±2.38)μM、(99.80±2.130 μM、(29.03±2.05)μM、(47.33±2.23)μM。4、经TGT-7、9、13和15处理后,A549细胞的划痕相对宽度明显高于空白对照组,且具有统计学意义。TGT-7、9、13处理后,A549细胞的侵袭数目相比对照组分别降低了 35.4,39.2,6.2,且具有统计学意义。5、A549细胞经过TGT-7、9、13处理后,G0/G1期的细胞分别为(75.58 ± 0.44)%、(71.63 ± 2.02)%、(80.27 ± 2.13)%,与空白对照组(65.31±3.79)%相比具有统计学差异(n=3,P<0.01);经过TGT-15处理后,G0/G1期的细胞为(69.17±1.05)%,与空白对照组相比具有统计学差异(n=3,P<0.05)。经高、低两个浓度的TGT-7处理后,A549细胞的凋亡率分别为(]5.23±0.70)%和(29.14±1.45)%,与空白对照组(3.85±0.02)%相比,具有统计学差异(n=3,P<0.01);经TGT-9处理后,凋亡率分别为(7.65±0.44)%和(15.94±0.46)%,与空白对照组相比,具有统计学差异(n=3,P<0.01;n=3,P<0.001);经TGT-13处理后,凋亡率分别为(18.35±0.93)%和(33.37±1.02)%,与空白对照组相比,具有统计学差异(n=3,P<0.01;n=3,P<0.001);经TGT-15处理后,凋亡率分别为(5.54±0.13)%和(11.35± 1.23)%,与空白对照组相比具有统计学差异(n=3,P<0.01);高、低浓度之间也有统计学差异。JC-1染色后,TGT-7、9、13和]5处理后的红绿荧光比值分别为 1.07±0.92,1.94±0.35,1.58±0.74,3.28±0.57,且与对照组8.08±1.31相比,具有统计学差异(n=3,P<0.001)。DCFH-DA染色后,经TGT-7、9、13处理后,平均荧光强度分别为1251±78、1379±94、792±86,与空白对照组464±28相比具有统计学差异(n=3,P<0.001);TGT-15处理后,平均荧光的强度为534±21,与空白对照组0.66±0.34相比具有统计学差异(n=3,P><0.05)。6、经TGT-7、9、13和15处理后,A549细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达明显下降;Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax/Bcl-2比值明显增大;细胞浆中Cytochrome C蛋白表达明显升高。且呈现剂量依赖性。结论1、在最佳提取纯化工艺条件下可制得含量较高(>60%)的通关藤总皂苷,且方法简单易行,可扩大生产。2、通过系统的化学成分研究,补充了傣药通关藤中C21甾体类化学成分,丰富了通关藤的化学成分类型。3、通关藤C21甾体类化合物为其主要抗A549细胞生长的活性物质。4、TGT-7、9、13和15抑制A549细胞生长和转移的可能作用机制如下:①将A549细胞周期阻滞于G0/G1期。②通过下调MMP-2和MMP-9而抑制A549细胞的迁移和侵袭。③通过降低A549细胞线粒体膜电位和增加细胞内活性氧的浓度诱导A549细胞的凋亡。④通过线粒体途径诱导凋亡,其机制为:上调A549细胞中Bax/Bcl-2的比率、促进Cytochrome C向细胞质中的释放。